基于转录组学和代谢组学研究脐橙-黄龙病菌-柑橘木虱的互作机制

来源 :南昌大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhiping1209
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柑橘是我国栽培面积及产量最大的水果,具有重要的经济地位。柑橘木虱(ACP)及其传播的柑橘黄龙病(HLB)严重制约了柑橘产业的发展。我国的柑橘HLB是由亚洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)导致。HLB潜伏期较长,暂无彻底治愈方法,而CLas也暂时无法纯培养,因此限制了对柑橘-CLas-ACP三者相互作用的理解。研究柑橘响应CLas侵染和ACP取食胁迫的代谢变化和防御机制具有积极的科学意义。本文首先研究了果园中感染HLB不同症状的纽荷尔脐橙(Citrus sinensis Osbeck)叶对CLas侵染的代谢变化;然后,以一年龄纽荷尔脐橙嫁接苗为试验材料,利用套袋法将健康ACP(ACP-)和携带CLas的ACP(ACP+)分别取食脐橙叶24 h和72 h,对照组(CK)套空袋处理,得到CK、ACP-24 h、ACP+24 h、ACP-72 h和ACP+72 h共5组处理样品,基于代谢组学和转录组学全面分析脐橙叶响应ACP-和ACP+取食胁迫的代谢调控机制,进一步采用Y型嗅觉仪测试脐橙差异挥发物对ACP-和ACP+行为选择的影响,初步了解脐橙-CLas-ACP的互作机制。主要研究结果如下:(1)采用基质辅助激光解吸电离质谱技术(MALDI-TOF-MS)检测果园脐橙叶,感染CLas后脐橙叶代谢物种类和丰度发生了明显变化。主成分分析(PCA)显示HLB不同症状的叶可与健康叶明显区分,采用正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)模型的变量投影重要性(VIP值),筛选了32种脐橙响应HLB的差异代谢物,其中柠檬酸和苹果酸含量随叶中CLas滴度增加而下降,可能是病原菌利用宿主苹果酸和柠檬酸进行三羧酸循环(TCA)导致。MALDI-TOF-MS结合多变量分析,从脐橙响应CLas的代谢层面建立了HLB快速检测方法,判别正确率达100%,具有高通量、快速筛查HLB的潜力。(2)采用动态顶空吸附结合气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对脐橙响应ACP-和ACP+取食胁迫的挥发性有机化合物(VOCs)进行分析,从CK、ACP-24 h、ACP+24 h、ACP-72 h和ACP+72 h 5组样品中共鉴定25种VOCs,主要是单萜、倍半萜和醇等,其中9种是胁迫后新增VOCs,包括3-蒈烯、顺式-4-侧柏醇、顺式-芳樟醇氧化物、α-松油醇、香茅醇、顺式-柠檬醛、柠檬醛、水杨酸甲酯(Me SA)和乙酸橙花酯。随着取食时间的增加,脐橙VOCs种类和含量先增加后下降,在ACP+24 h组最丰富。OPLS-DA分析结果表明,相同处理时间,ACP-和ACP+组间的差异VOCs为3E,5E-2,6-二甲基-1,3,5,7-辛四烯、月桂烯、3-蒈烯、柠檬醛和顺式-柠檬醛5种,主要富集在香叶醇降解途径,可能与CLas的介导有关。(3)根据GC-MS结果筛选出了8种具有显著差异的脐橙VOCs,利用Y型嗅觉仪测试健康ACP-和带菌柑橘木虱ACP+对其选择偏好性(P<0.05)。与空气和溶剂对照比较,基于选择诱集率和选择系数结果来确定各挥发物对ACP+和ACP-是否具有显著的引诱或趋避作用(P<0.05)。研究结果表明,3-蒈烯、d-柠檬烯、芳樟醇、Me SA、香茅醇和柠檬醛6种VOCs对ACP-具有显著的引诱作用,β-石竹烯和β-环柠檬醛对ACP+具有引诱作用,而3-蒈烯、芳樟醇、香茅醇和柠檬醛对ACP+具有趋避作用。ACP+取食明显促进脐橙叶中对ACP-有吸引作用的3-蒈烯、d-柠檬烯、芳樟醇和Me SA的释放,从而吸引ACP-有助于CLas的扩散,VOCs可能在脐橙-CLas-ACP互作中发挥重要作用。(4)基于超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术(UPLC-QTOF-MS)结合UNIFI数据处理平台,对上述5组样品进行了非靶向代谢组学分析,在正、负离子模式下共鉴定93种化合物,包括11种糖类、4种核苷酸、8种氨基酸、16种有机酸和42种类黄酮及其衍生物等。无论是否带菌,ACP-和ACP+处理均显著降低了橙皮素、D-葡萄糖、12-氧代植物二烯酸、茉莉酸、茉莉酸甲酯等代谢物的含量,显著增加了5-甲基胞苷、泽兰林素、松二糖、D-葡糖-6-磷酸、3-对香豆酰基奎宁酸含量,可能与柑橘木虱取食有关。与ACP-比较,ACP+取食显著降低了忍冬苦苷、半齿泽兰素-5-甲醚、山奈素、苜蓿素、甜橙素、茉莉酸甲酯、12-氧代植物二烯酸等含量,增加了染料木苷、异柠檬酸等含量,可能是CLas的介导影响。偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)分析表明5组样品代谢物具有显著差异,组间可以较好得区分。OPLS-DA结果表明,ACP-24 h和ACP+24 h差异代谢物包括山奈酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、柠康酸、L-苹果酸、富马酸和异柠檬酸等;ACP-72 h和ACP+72 h差异代谢物包括甘油-3-磷酸、橙皮素、9(S)-过氧氢基-10(E),12(Z),15(Z)-十八碳三烯酸等。KEGG通路分析表明,代谢物显著富集在α-亚麻酸代谢(茉莉酸代谢)、TCA、类黄酮的生物合成等途径,可能是脐橙-CLas-ACP互作的重要代谢通路。(5)利用Illumina二代测序平台研究了5组脐橙叶的转录组学变化,以|Log2FC|>1且P-value<0.05为条件共筛选了6188个差异表达基因(DEG),并进行了DEG的GO功能注释和KEGG通路富集等分析。与CK比较,随着胁迫时间的增加,ACP-诱导的DEG数量从24 h的3193个下降至72 h的1132个,ACP+诱导的DEG数量从24 h的1873个下降至72 h的879个,ACP+组的DEG数量较ACP-少,可能是CLas减少了ACP+诱导的DEG。GO功能注释结果显示,与CK比较,ACP-和ACP+取食胁迫24 h诱导的DEG主要参与分子功能,如ADP结合、血红素结合、四吡咯结合等;而胁迫72 h后主要富集到分子功能和细胞过程,包括水解酶活性、血红素结合、四吡咯结合、铁离子结合、几丁质酶活性、氨基聚糖分解过程、几丁质代谢过程等。DEG显著富集的KEGG通路主要涉及脐橙次生代谢和光合作用等,其中苯丙烷生物合成途径最显著,代谢组学分析结果中显著富集的类黄酮代谢途径是苯丙烷代谢的一个重要分支,可能在脐橙-CLas-ACP互作中发挥重要作用。此外,从DEG中筛选出507个差异长链非编码RNA(lnc RNA),表达量最高的为LOC102613525,取食胁迫后新增9个lnc RNA。与CK比较,表达量热图结果显示在ACP-和ACP+取食胁迫相同时间下lnc RNA的变化不同,可能与CLas的介导相关。(6)结合GC-MS和UPLC-QTOF-MS代谢组学分析共鉴定129种化合物,KEGG通路显著富集在香叶醇降解、水杨酸代谢和茉莉酸代谢等途径。结果显示,不管是否带菌,柑橘木虱取食胁迫均诱导释放香叶醇降解途径的柠檬醛和顺式-柠檬醛,而该途径中Cs ADH和Cs ADH3基因表达上调。柑橘木虱取食诱导脐橙的水杨酸代谢释放大量Me SA,显著上调系统获得抗性(SAR)中部分植物病程相关基因非表达子(Cs NPR)和病程相关蛋白(Cs PR)基因表达水平,筛选出可能参与防御反应的转录因子为Cs WRKY48。而胁迫诱导水杨酸代谢途径拮抗的茉莉酸代谢相关基因Cs AOS、Cs AOC、Cs JAR1和Cs JAZ表达下调,可能与茉莉酸、12-氧代植物二烯酸、9(S)-过氧氢基-10(E),12(Z),15(Z)-十八碳三烯酸和茉莉酸甲酯等茉莉酸代谢途径相关化合物含量下降有关。本文系统地研究了脐橙响应ACP-和ACP+取食胁迫24 h和72 h后的代谢组学和转录组学变化。研究结果表明,ACP-和ACP+取食诱导脐橙VOCs代谢差异,其中ACP+显著诱导释放3-蒈烯、d-柠檬烯、芳樟醇和Me SA吸引ACP-,可能是CLas的宿主调控机制。胁迫诱导脐橙水杨酸代谢途径积累Me SA并激活SAR,上调防御基因Cs NPR、Cs PR和Cs WRKY48的表达,同时抑制茉莉酸代谢途径的基因表达和物质合成。ACP+取食胁迫抑制差异基因的数量,减少忍冬苦苷等类黄酮化合物含量。结果表明CLas介导了脐橙对ACP的转录组学和代谢组学响应,研究结果为柑橘-CLas-ACP的互作机制提供了理论基础,有助于ACP和HLB的防控和管理。
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