版纳病毒(Banna Virus)是呼肠孤病毒科病毒,2005年国际病毒命名委员将版纳病毒列为东南亚十二节段RNA病毒属(Seadornavirus)的模式病毒。自1987年首次从云南西双版纳病人标本中分离以来,相继在位于北温带、亚热带以及热带(赤道至北纬42度)的中国、印度尼西亚、越南等国家的猪、牛、蜱以及3属10种蚊虫标本中分离。由于直接从病人标本中分离到病毒本并从病人血清中检测到病毒抗体,版纳病毒被认为是一种引起人类发热和病毒性脑炎的重要新发传染病的病原体,引起了国内外病毒学家和疾病预防控制专家的极大关注。本研究首先大规模测定版纳病毒全基因组序列并对病毒全基因组特征进行系统分析,在此基础上运用多种生物信息学理论与方法分析了不同分离年代、不同分离地区、不同宿主来源的版纳病毒的系统进化、分子溯源、种群动态以及空间迁徙路线及动力。本研究是国际上首次开展的版纳病毒相关研究,研究结果对于解释版纳病毒的分子进化和起源等病毒学理论问题以及制定该病毒所引起疾病的预防控制策略等均具有重要意义。结果报告如下：1.版纳病毒的全基因组序列的测定本研究首先测定了我国分离的20株版纳病毒全基因组核苷酸序列,病毒分离自3属10种蚊虫标本；分离地纵贯我国亚热带及北温带包括云南省、山西省、甘肃省、北京市、辽宁省及内蒙古自治区；分离年份从1995年至2007年。病毒全基因组测定质量分析结果显示,平均质量值为30.34,准确性达到98.9%,提示序列的质量具有较高的信度。这也是国际上首次完成的大规模版纳病毒全基因组序列测定。本研究在测定版纳病毒全基因组序列测定过程中采用自行设计的2套病毒全基因组扩增引物,这些扩增引物具有特异性好,工作稳定等特点,该方法与双链RNA病毒基因组传统测定方法相比工作效率大大提高。2.版纳病毒全基因组序列特征分析版纳病毒基因组全长约21,000 bp,由12条分节段的双链RNA组成,各基因节段长度从759 bp到3747 bp大小不等。病毒基因组富含嘌呤和嘧啶核苷酸(A+T含量为58.19%-65.39%),各节段均具有紧凑的尺寸冗余序列少的特点。版纳病毒各基因节段均为单顺反子结构,仅含有一个开放读码框编码对应的病毒蛋白质分别称为VP1-VP12。分析结果显示,版纳病毒基因组中存在许多高度保守的区域,这些区域是保持病毒功能的重要活性位点同时这些保守区也是对版纳病毒进行分子诊断的理想靶标区域。版纳病毒全基因组核苷酸序列同源性分析结果显示,版纳病毒各基因节段的氨基酸同源性均高于核苷酸同源性,表明大多数突变位点位于密码子的第三位并不引起编码氨基酸的改变。版纳病毒第1-12节段基因组的同源性存在较大差异,其中第12基因节段最为保守(>84.8%,μ=92.5%),而第9基因节段变异度最大(>37.8%,μ=81.53%)。版纳病毒各基因节段中均可检测到碱基的缺失、插入、重组和重配以及基因倍增,提示版纳病毒各基因节段的基因组结构并非严谨而是一个不断丢失和获得遗传物质的动态结构,这种动态的,多重的基因组结构改变应该是版纳病毒发生适应性进化的驱动力。以病毒全基因组为基础的系统进化分析结果显示,版纳病毒可以分为两个基因型别,基因A型和基因B型,基因A型分为由北方分离株组成的A1亚型和南方分离株组成的A2亚型,体现出明显的地域分布特征。版纳病毒基因A1、A2亚型存在型别特征性的氨基酸位点,是版纳病毒在进化过程中积累的遗传差异,更是深入开展版纳病毒病原性研究的重要分子靶标。对版纳病毒各基因节段的系统进化分析结果显示,版纳病毒第12节段基因结构保守、具有足够的用于基因分型的信息位点、更重要的是该基因节段所绘制的基因进化树与病毒全基因的分析结果基本相同,因此版纳病毒第12基因节段序列信息可以作为该病毒基因分型的分子基础(本章节部分研究结果已发表(EID,2010)。进一步分析发现,版纳病毒各基因节段的进化谱系图并不完全一致,表明版纳病毒各个基因在进化上具有不同的特点。3.版纳病毒分子溯源与地理迁徙分析为了开展版纳病毒基因组的时空动力学研究,本研究使用本课题测定的20株版纳病毒全基因因组序列数据以及从国际基因库(GenBank)下载目前仅有的4株版纳病毒全基因组序列,构建了版纳病毒全基因组非冗余序列联配数据集。使用BEAST、PAUP、Phylip以及MigraPhyla软件进行病毒选择压力、分子溯源、种群进化动态以及地理迁徙分析。研究结果显示,版纳病毒在自然界主要受净化选择压力,即大部分有害的突变被净化选择压力清除。版纳病毒基因组的平均碱基替换速率在103—10-4数量级,与呼肠孤病毒属的其他病毒如蓝舌病毒、轮状病毒等进化速率相当。由于所受选择压力不同,版纳病毒的不同基因节段表现出不同的碱基替换速率,最快的为第9基因节段(1.345*10-2/核苷酸位点/年),而第12基因节段最慢(4.33*10-4/核苷酸位点/年)。碱基替换模型计算结果显示,版纳病毒基因组序列的变化以嘧啶之间的互换(C-T)最常见,其次是嘌呤之间的互换(A-G)。在序列中置换(Transition)的比率高于颠换(Transversion)。除第11基因节段的最适碱基替换模型为HKY外,其余基因节段的碱基替换模型均为GTR。基于MCMC算法,利用BEAST软件对版纳病毒全基因组序列进行分子溯源和种群进化动态分析,结果显示版纳病毒最近共同进化祖先出现时间为距今315年前(95%HPD：63-619),其中基因A型和基因B型的共同进化祖先出现的时间分别距今217年(95%HPD：51-424)和49年(95%HPD：31-74)。基因A1亚型和A2亚型的最近共同祖先出现的时间分别为距今92年前(95%HPD：21-192)和164年前(95%HPD：36-327)。根据目前已知的版纳病毒毒株分离年代信息推断,中国南方分离株组成的基因A2亚型的版纳病毒是最古老的版纳病毒种群。种群动态分析结果显示,版纳病毒的种群多样性自1980年开始一直处于缓慢下降状态,2000年一2005年版纳病毒种群多样性明显下降,至2005年前后降至最低点,目前版纳病毒的种群多样性维持在101-102之间。空间动力学研究表明,中国云南省、甘肃省和辽宁省是版纳病毒的三个潜在播散地。追溯版纳病毒的迁徙路线发现其与我国候鸟的迁飞路线高度拟合,提示候鸟的迁徙在版纳病毒的播散中起到了重要的作用。4.总结本课题在国际上首次以不同时间、地点、宿主来源的版纳病毒毒株全基因组序列测定为基础,获得了版纳病毒种群基因组一级结构全貌,精准定位了版纳病毒基因组中高度保守区段、探明了型别特异性分子靶标、明确了版纳病毒进化变异的动力并阐释了版纳病毒基因重配产生的动力,为深入开展版纳病毒的病原学研究进行了有效的基因组分子数据的挖掘与分析。同时采用目前国际最先进的分析方法对版纳病毒基因组开展了系统的生物信息学研究,阐明了基因组数据所蕴藏的生物学意义：明确了版纳病毒分子分型及毒株之间亲缘关系、追溯了版纳病毒的分子起源时间及种群进化动态、重建了版纳病毒的迁徙路线。具体结论如下：的分子起源时间及种群进化动态、重建了版纳病毒空间迁徙路线并推断了其迁徙动力。这些研究结果不仅丰富了版纳病毒的分子生物学基础数据为进一步深入开展版纳病毒的病原学研究奠定了基础,更为科学的制定版纳病毒的防控策略提供了依据。