【摘 要】
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河豚毒素（Tetrodotoxin,TTX）和冈田酸（Okadaic acid,OA）是水产品中危害性较大的海洋毒素,它们在水产品中不断被蓄积,对人类生命安全产生威胁。海洋毒素的检测方法常用酶联免疫试剂盒（ELISA试剂盒）,难以实现多种毒素快速现场检测。因此,构建多毒素现场快速检测技术对沿海地区水产品安全与监督有重要的应用价值。本论文为定量检测水产品中的OA和TTX毒素,将时间分辨荧光微球作为信
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河豚毒素（Tetrodotoxin,TTX）和冈田酸（Okadaic acid,OA）是水产品中危害性较大的海洋毒素,它们在水产品中不断被蓄积,对人类生命安全产生威胁。海洋毒素的检测方法常用酶联免疫试剂盒（ELISA试剂盒）,难以实现多种毒素快速现场检测。因此,构建多毒素现场快速检测技术对沿海地区水产品安全与监督有重要的应用价值。本论文为定量检测水产品中的OA和TTX毒素,将时间分辨荧光微球作为信号报告因子与层析技术联合应用,完成了TTX免疫层析方法和TTX-OA同步检测方法的构建。在此基础上,构建OA单链抗体的原核表达载体,诱导表达后进行了简单的筛选和鉴定。主要研究内容及结果如下:（1）建立TTX荧光免疫层析方法,实现水产品中TTX的定量检测。通过甲醛法自制的人工抗原（TTX-BSA）和生物素-牛白蛋白（biotin-BSA）分别被喷涂在试纸条纤维素膜的不同位置作为检测线和质控线,抗体-微球结合探针制备后进行表征,构建了TTX荧光试纸条检测技术,线性范围在0.5 ng/m L-40 ng/m L之间,TTX的线性拟合方程为y=-0.2668x+0.57365（R~2=0.9940）,检测限（Limit of detection,LOD）为0.047 ng/m L。加标样品检测中的回收率为97.08%-101.86%,标准偏差低于4.70%。该方法具有成本低、灵敏度高等优势,有利于TTX的快速定量检测。（2）基于化学方法制备OA抗原并生物合成单链抗体。OA人工抗原通过活化酯法合成后利用红外光谱等方法验证。红外图谱中蛋白在3422 cm-1和1655 cm-1处显示了羧基特征峰。抗原中-CONH-的C=O的波数为1661 cm-1,-NH的波数在3431 cm-1。由上述表明OA完全抗原成功合成。OA单链抗体是基于基因工程技术生物合成的一种具有特异性的新型免疫元件,有望代替可能产生伦理问题的动物实验制备抗体。构建目的基因表达载体,大肠杆菌诱导表达后进行验证,ELISA鉴定结果中阳性与阴性对照比值高于2.1（P/N＞2.1）,检测结果呈阳性,证明了单链抗体具有一定的特异性。（3）建立TTX和OA同步检测的荧光免疫层析技术,实现水产品中TTX-OA检测。本研究将TTX-OA包被抗原和biotin-BSA分别作为检测线和质控线,合成单克隆抗体-微球探针,建立用于水产品检测的TTX-OA双通道免疫层析试纸条方法。在p H为7,抗体微球比例为1:10,反应时间为12 min等条件下,TTX的线性拟合方程为YTTX=-0.2624X+0.8247（R~2=0.9916）,LOD=0.167 ng/m L。OA的线性拟合方程为YOA=-0.4333X+1.1133（R~2=0.9849）,LOD=1.624 ng/m L,该方法的变异系数低于10%,且回收率为84.48%-111.90%。该方法的检测结果与仪器法检测结果一致,并且试纸条在储藏条件为4℃时可存储一年以上,可实现水产品中两种海洋毒素的同时定量检测。
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