目的:滤泡辅助T（Follicularhelper T,Tfh）细胞根据其在机体内的解剖位置可以分为生发中心 Tfh（Germinal center-Tfh,GC-Tfh）细胞和循环 Tfh（circulating Tfh,cTfh）细胞。位于淋巴组织中的GC-Tfh细胞的主要功能是辅助生发中心的形成,调节B细胞增殖,辅助B细胞产生抗体,维持机体的体液免疫。cTfh细胞是一群位于外周血中表达CXCR5的记忆CD4+T细胞,同样表达GC-Tfh细胞基本的功能表型ICOS、PD-1,分泌IL-21、IL-4等特征性细胞因子,继而辅助B细胞产生抗体。由于次级淋巴组织不易获得,这使得人类Tfh细胞的研究非常困难。因此,越来越多的研究开始使用cTfh细胞以研究人类Tfh细胞在疫苗反应或疾病状态中的作用及机制。获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS）的病原体是人类免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus,HIV）,HIV会攻击并逐渐破坏机体免疫系统,引起各种机会性感染和肿瘤的发生。Tfh细胞的代谢与其分化发育和效应功能紧密相关,然而目前针对Tfh细胞代谢的研究较少,且集中于自身免疫疾病,Tfh细胞在HIV感染过程中的代谢变化、代谢对其功能的影响尚无文献报道。此外,HIV感染过程中,Tfh细胞内的病毒含量高于CD4+T细胞中其他细胞,即non-Tfh细胞,但代谢在其中是否发挥作用也未见研究。本研究旨在检测HIV感染者cTfh细胞的代谢变化,分析其与HIV疾病进展和临床转归的关系,找到其中明显发生变化并发挥重要作用的细胞代谢（论文一）,进一步研究代谢对cTfh细胞的功能的影响（论文二）,随后探究代谢对HIV感染cTfh细胞的作用及其中可能存在的机制（论文三）,为HIV感染者免疫功能的恢复和体内病毒的清除提供新的思路和方向。研究方法:1.研究对象本研究纳入研究对象包括68例健康人,58例未治疗HIV感染者,55例治疗后HIV感染者。健康对照者为HIV抗体阴性的健康志愿者,年龄及性别比例与HIV感染者均匹配。参与本课题研究的所有志愿者及感染者均来自中国医科大学附属第一医院红丝带门诊和体检中心,所有研究对象均签署了知情同意书,并通过了中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准。2.HIV病毒载量水平检测采集研究对象全血并分离出血浆,检测方法采用实时定量PCR方法,仪器为美国Roche公司的COBAS AMPLICOR自动载量仪。低于检测下限20 copies/μL的结果显示为＜20,HIV阴性显示为0。3.CD4+T细胞绝对值计数检测采集研究对象外周静脉血,将CD4/CD8/CD3 TriTEST试剂分别加入绝对计数管中,并加入抗凝全血,室温条件下避光染色后加入免洗溶血素,室温下避光孵育15分钟后使用BD Calibur流式细胞仪检测。4.多种营养物质转运体表达水平检测提取研究对象外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。洗涤后使用Human TruStain FcXTM进行Fc段阻断以降低非特异染色,随后进行表面染色,使用的流式染料包括 CD3-PE-Cy7、CD4-APC-Cy7、CD45RA-BV510、CXCR5-BV711、Glut1-PE、CD36-APC、FATP-1-Alexa Fluor647、CD71-APC、CD98-PE、CXCR3-PE-Cy5、CCR6-PE-Cy7,7-AAD,使用 BDFACSLSRⅡ流式细胞仪检测。5.线粒体表型和活性氧含量检测提取PBMC洗涤后,加入37℃预热的PBS,随后加入MitoTracker Green、CMTMRos、CellROX,37℃孵育30min,用PBS洗涤两遍。继续进行后续表面染色后上机检测。6.细胞凋亡水平检测提取 PBMC 后使用 EasySepTM Human CD4+T Cell Isolation Kit 负选出 CD4+T细胞,37℃、5%CO2的条件下培养24h。收集细胞表面染色后洗涤,加入Annexin-V和7-AAD,无需洗涤,直接进行流式检测。7.cTfh细胞效应功能分子及产生的细胞因子检测负选的CD4+T使用Fixable Viability Stain 620进行死活染色、表面染色后使用Fixation/Permeabilization Solution Kit 进行细胞破膜,洗涤后加入 IL-21-BV421、IL-4-APC,染色结束后使用Fixation/Permeabilization Solution Kit配置破膜染色洗液,洗涤后上机检测。ICOS-BV421可直接通过表面染色被检测到,CD40L需要使用DynabeadsTM CD3/CD28抗体刺激,未刺激细胞作为对照组。8.核内因子Ki67和Bcl-2水平检测提取 PBMC 进行表面染色后,使用 eBioscienceTM Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set对细胞进行破核,洗涤后加入Ki67-PE、Bcl-2-FITC,染色结束后使用 eBioscienceTM Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set 配制破核染色洗液,洗涤后流式上机检测。9.干预细胞代谢实验负选未治疗HIV感染者的CD4+T细胞,相应孔中分别加入2-DG（5mM）、Sodium Oxamate（20mM）、BCH（10mM）、DON（2μM）,对照组加入同等体积的PBS,37℃、5%CO2条件下孵育24h。检测干预细胞代谢对ICOS表达的影响需要在加入抑制剂2h后,使用DynabeadsTM CD3/CD28抗体活化以放大效果。10.细胞活化表型和共抑制受体水平检测提取PBMC进行表面染色,使用的荧光抗体有CD3-Percp-Cy5.5、CD4-APC-Cy7、CD45RA-BV510、CXCR5-BV711、CD25-PE-Cy7、CD69-APC、HLA-DR-PE、TIGIT-BV421、PD-1-PE-Cy7。染色方法如前所述。11.糖摄取能力检测提取PBMC洗涤后,加入37℃预热的无糖1640培养基,随后加入100μM 2-NBDG,37℃孵育30min,用PBS洗涤两遍。继续进行后续表面染色后使用上机检测2-NBDG水平。12.代谢相关信号通路检测提取 PBMC 进行表面染色后,使用 eBioscienceTM Intracellular Fixation＆Permeabilization Buffer Set进行细胞固定,洗涤后使用预冷的50%甲醇破膜,洗涤后加入p-S6-APC、p-Akt-Alexa Fluor 488,染色结束后使用提前配置的破膜染色洗液洗涤细胞,洗涤后上机检测。c-myc-Alexa Fluor488、HIF-1α为核内因子,实验方法如前所述。13.HIV感染性克隆的制备转染前一天在培养平板中加入293T细胞,培养12-24h使细胞覆盖平板的80%-90%。将pNLENG-IRES和Lipo 2000通过DMEM混合。随后吸弃293T细胞培养平板中的培养基,加入5ml DMEM。随后将质粒和Lipo2000混合物小心加入293T细胞培养平板中,37℃、5%CO2孵育5小时后吸弃培养平板中上清,加入DMEM+1 0%FBS,37℃、5%CO2孵育48小时。收取上清后用冻存管分装,每管1ml,储存于-156℃冰箱备用。14.体外HIV感染实验负选健康人的CD4+T细胞,加入IL-2过夜培养。第二天加入PHA以活化细胞,继续培养3天。取出冻存的感染性克隆NLENG,加入细胞培养管,离心感染。离心结束后洗涤细胞,加入IL-2继续培养3天。感染结束后洗涤细胞,使用Fixable Viability Stain 620 进行死活染色,CD45RO-BV510、CXCR5-BV711 进行表面染色,染色条件如前所述。加入1%多聚甲醛固定细胞后,细胞培养管进行上机检测。15.干预细胞代谢及信号通路实验在体外感染实验中引入干预细胞代谢及信号通路的相关试剂,在活化细胞前2h加入 STF-31（100nM）、2-DG（5mM）、UK5099（25μM）、3-PO（1μM）、Sodium Oxamate（20mM）、Oligomycin（2μg/ml）、BCH（10mM）、DON（2μM）、Rapamycin（200nM）、Mycro-3（10μM）、BAY87（10μM）,对照组加入同等体积的 PBS 或 1%DMSO。离心感染结束后,将以上试剂加回至相应管中继续培养。16.统计学分析用GraphPad Prism 6和SPSS 20.0软件对实验结果进行统计学分析。不符合正态分布的数据之间三组比较用Kruskal-Wallis检验,两组比较用Mann-Whitney U检验,相关性分析用Spearman秩相关检验。Wilcoxon配对检验用于两组之间配对秩和检验,检验均为双侧检验,p＜0.05被认为存在显著的统计学差异。研究结果:（一）HIV感染者的循环滤泡辅助T细胞代谢变化的研究1.HIV感染者cTfh细胞的糖代谢、氨基酸代谢和铁代谢相关的营养物质转运体表达水平显著升高与健康人相比,未治疗HIV感染者cTfh细胞的葡萄糖转运体Glut1、转铁蛋白受体CD71、氨基酸转运蛋白CD98表达水平显著升高,治疗后患者cTfh细胞的Glut1和CD71的表达水平显著降低,与健康人无明显差异,而CD98在治疗后患者cTfh细胞中的表达仍然显著高于健康人。脂代谢相关转运体CD36和FATP-1的表达在健康人与HIV感染者之间的表达无明显差别。2.HIV感染者cTfh细胞线粒体代谢与健康人相比无明显变化我们使用穿细胞膜染料对胞内细胞器进行染色,通过流式检测后发现线粒体质量、线粒体膜电位及胞内活性氧自由基在健康人与HIV感染者之间的表达水平无明显差异。3.cTfh细胞亚群之间代谢指标表达有明显差异根据CXCR3和CCR6的表达可以划分出4个cTfh细胞亚群,其中数量较多的是cTfh1、cTfh2和cTfh17亚群。cTfh各亚群所占比例在健康人和HIV感染者之间无明显变化。cTfh2亚群细胞表达的Glut1、CD71、CD98的水平显著低于cTfh1和cTfh17亚群,cTfh1亚群的CD71表达水平高于cTfh17亚群,CD98表达水平低于cTfh17 亚群。4.cTfh细胞的多个代谢指标的表达水平与HIV疾病进展相关HIV感染者cTfh细胞表面Glut1、CD36、CD71、CD98、线粒体质量、活性氧自由基与CD4+T细胞绝对计数呈负相关,CD98、线粒体质量MM、活性氧自由基ROS的水平与HIV病毒载量呈正相关,FATP-1与病毒载量呈负相关。5.cTfh细胞表面的Glut1、CD71、CD98可能是HIV临床转归重要的代谢相关营养物质转运体根据对所有数据的归纳总结,我们发现,cTfh细胞的Glut1、CD71、CD98既在HIV感染者中显著升高,又与HIV疾病进展或免疫恢复密切相关。（二）HIV感染者循环滤泡辅助T细胞的功能与代谢变化的关系研究1.HIV感染者的cTfh细胞数量减少,但增殖能力没有减弱与健康人相比,cTfh细胞在CD4+T细胞中的百分比在未治疗HIV感染者中显著降低,治疗后患者cTfh细胞的百分比和绝对值显著高于未治疗HIV感染者;cTfh细胞数量虽然减少,但增殖能力并未明显减弱,表现为增殖指标Ki67在未治疗HIV感染者cTfh细胞中的表达水平升高;健康人和治疗后感染者cTfh表达Ki67的水平显著高于non-cTfh细胞。2.HIV感染者cTfh细胞凋亡水平升高,与CD4+T细胞绝对计数呈负相关cTfh细胞数量减少与凋亡有关,表现为与健康人相比,未治疗HIV感染者cTfh细胞早期凋亡和晚期凋亡比例显著升高,并且与CD4+T细胞绝对计数负相关,且cTfh细胞的早期凋亡和晚期凋亡比例明显高于non-cTfh细胞。3.HIV感染者cTfh的ICOS、IL-21表达水平升高,与疾病进展相关与健康人相比,HIV感染者cTfh细胞效应功能分子ICOS、IL-21显著升高,并且与CD4+T细胞绝对计数负相关,IL-21的表达水平与病毒载量呈正相关;CD40L和IL-4的表达则无明显变化。4.cTfh多个功能表型与其代谢相关营养物质转运体的表达水平显著相关cTfh细胞的早期凋亡细胞所占百分比与Glut1的表达水平呈正相关,晚期凋亡细胞所占百分比与CD98的表达水平呈明显正相关;cTfh细胞功能表型ICOS的百分比与Glut1和CD98的表达水平呈正相关,产生的细胞因子胞内IL-21与CD98表达水平呈正相关。5.抑制cTfh糖代谢及氨基酸代谢会影响其功能及凋亡水平作为葡萄糖类似物,2-DG可以竞争性抑制细胞摄入葡萄糖,使用2-DG抑制未治疗HIV感染者cTfh细胞的糖代谢,可以观察到cTfh表达ICOS的水平明显降低,但是凋亡比例增加;BCH和DON可以抑制细胞表面氨基酸转运蛋白的表达,使用BCH或DON抑制未治疗HIV感染者cTfh细胞的氨基酸代谢,我们发现cTfh细胞的凋亡比例显著减少。（三）循环滤泡辅助T细胞的代谢对HIV感染的作用及相关机制研究1.与non-cTfh细胞相比,cTfh呈现更高水平的病毒感染,同时高表达共抑制受体,且共抑制受体与Glut1、CD71、CD98的表达水平呈正相关使用携带GFP的HIV感染性克隆NLENG体外感染CD4+T细胞发现,cTfh细胞中GFP+比例显著高于non-cTfh细胞,说明与non-cTfh细胞相比,cTfh细胞更容易被HIV感染。cTfh细胞表面共抑制受体TIGIT、PD-1的表达水平显著高于non-cTfh细胞,同时TIGIT、PD-1的表达水平与代谢相关营养物质转运体Glut1、CD71、CD98之间存在显著正相关。2.与non-cTfh细胞相比,cTfh细胞多种代谢指标的表达水平更高cTfh细胞的葡萄糖转运体Glut1和氨基酸转运蛋白CD98的表达水平及糖摄取能力指标2-NBDG,线粒体质量、线粒体膜电位、活性氧自由基的含量均显著高于non-cTfh细胞,但转铁蛋白受体CD71的表达水平在non-cTfh细胞中更高。3.cTfh细胞活化水平显著低于non-cTfh细胞CD25、CD69和HLA-DR是常用的评估细胞活化状态的指标。通过流式检测我们发现,与non-cTfh细胞相比,cTfh细胞表面CD69的百分比无明显差异,但CD25、HLA-DR的百分比明显减少。4.cTfh细胞代谢相关信号通路蛋白的表达水平显著高于non-cTfh细胞S6和Akt分别是代谢信号通路mTOR亚单位mTORC1和mTORC2的下游,磷酸化的S6和Akt提示其处于激活状态。除mTOR外,c-myc和HIF-1α也共同参与细胞代谢的调控。结果显示cTfh细胞核内p-S6、p-Akt和c-myc的水平显著高于non-cTfh细胞,HIF-1α的表达在cTfh和non-cTfh细胞之间无明显差别。5.抑制糖代谢及氨基酸代谢抑制HIV感染cTfh细胞我们在体外感染实验中引入多种营养物质或转运蛋白的抑制剂以检测代谢对HIV感染cTfh细胞的影响。结果显示2-DG通过抑制细胞摄入葡萄糖抑制HIV感染cTfh细胞,BCH、DON通过抑制氨基酸代谢抑制HIV感染cTfh细胞,表现为与对照组相比,2-DG、BCH、DON处理组cTfh细胞的GFP+比例显著降低。6.阻断cTfh细胞的代谢相关信号通路会影响HIV对其感染效果我们继续在体外感染实验中引入代谢通路的抑制剂。Rapamycin可以靶向抑制mTORC1;Mycro-3是一种选择性Myc-Max二聚化抑制剂,可以有效抑制c-myc;BAY 87可以降低HIF-1α水平。结果显示,与对照组相比,Rapamycin处理组cTfh细胞的GFP+比例显著降低,Mycro-3和BAY87处理组cTfh细胞的GFP+比例明显升高。结论:1.HIV感染者cTfh细胞多种营养物质转运体的表达水平有不同程度地升高,cTfh亚群之间的营养物质转运体的表达也各有差异,此外,cTfh细胞多种细胞代谢指标与HIV疾病进展及免疫恢复有明显的相关性;2.未治疗HIV感染者cTfh细胞数量明显减少,但其增殖能力没有减弱,而凋亡细胞比例增加。cTfh细胞的凋亡水平及ICOS和IL-21的表达与代谢相关营养物质转运体的表达明显相关。抑制未治疗HIV感染者cTfh细胞的氨基酸代谢可以抑制其凋亡水平,抑制糖代谢会促进凋亡,但可以抑制cTfh表面ICOS的表达;3.与non-cTfh细胞相比,cTfh细胞更容易被HIV感染。cTfh表面高表达共抑制受体与营养物质转运体的表达明显相关。与non-cTfh细胞相比,cTfh细胞整体呈现高糖代谢、高氨基酸代谢、高线粒体代谢的状态,这种状态与活化水平无关,而与其自身代谢相关信号通路更活跃有关。抑制糖代谢、氨基酸代谢或代谢信号通路mTORC1可以显著抑制HIV对cTfh细胞的感染。