【背景】镉是一种重要的环境重金属毒物和人类Ⅰ类致癌物。环境中的镉可随食物和饮水进入人体,容易造成慢性镉蓄积,严重威胁人体健康。有文献报道,镉的过度蓄积可抑制免疫力,并有致癌、致畸、致突变作用,对全身多脏器都会造成损害。肾脏是主要的镉排泄和蓄积器官,是人体镉中毒后首先受损并发生功能失调的器官。当前研究显示镉中毒可导致肾小管功能障碍和不可逆的肾损伤[1],但具体机制尚未完全阐明。镉导致肾损伤的机制及寻找相关防治策略因此成为当前的研究热点[2,3]。硒元素参与构成体内部分抗氧化酶,是人体必需的微量元素之一,具有清除自由基和抗氧化的作用。然而,关于硒对镉的肾毒性是否有保护性拮抗作用及其作用机制尚未完全明确[4]。本课题旨在系统研究镉导致的大鼠肾组织损伤,并采用不同剂量硒预处理观察其对大鼠肾损伤的影响,初步研究硒干预影响镉肾毒性的可能机制,为镉污染的慢性毒作用防治研究提供基础的实验资料。【目的】1、通过建立慢性镉暴露致大鼠损伤的模型,探讨镉引起大鼠肾损伤的剂量-效应和时间-效应关系。2、研究不同剂量的硒干预对镉诱导大鼠肾损伤的影响。3、初步研究硒干预影响镉肾毒性的可能机制。【方法】SD雄性大鼠144只根据体重随机分为8组:(1)对照(去离子水,Con)组;(2)低镉(1 mg/kg CdCl2,1Cd)组;(3)中镉(3 mg/kg CdCl2,3Cd)组;(4)高镉(5mg/kg CdCl2,5Cd)组;(5)低硒(0.05 mg/kg Na2SeO3,0.05Se)组;(6)高硒(0.1mg/kg Na2SeO3,0.1Se)组;(7)低硒+高镉组(0.05 mg/kg Na2SeO3+5 mg/kg CdCl2,0.05Se+5Cd)(8)高硒+高镉组(0.1 mg/kg Na2SeO3+5 mg/kg CdCl2,0.1Se+5Cd),每组18只,给药方式为灌胃。每周记录大鼠体重,并按照10ml/kg的标准,根据大鼠体重确定灌胃溶液体积。灌胃时先给0.05Se+5Cd组、0.1Se+5Cd组的大鼠从低到高剂量灌硒,2h后再按Con组、1Cd组、3Cd组、5Cd组、0.05Se+5Cd组、0.1Se+5Cd组的顺序依次灌去离子水和镉,给药剂量根据文献并结合预实验确定。每天灌胃,连续3个月,建立慢性镉中毒致大鼠肾损伤模型,观察镉引起大鼠肾损伤的时效量效关系和硒对慢性镉中毒致大鼠肾毒性的作用。分别于1个月(1M)、2个月(2M)、3个月(3M)时每组随机抽取6只大鼠,通过腹主动脉采集大鼠血液,用高压灭菌过的手术器械剪取肾脏并称取肾脏湿重,计算肾脏脏器系数;采用电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-MS)检测全血和肾皮质中镉和硒水平;采用日立7020全自动生化仪检测血清中尿素氮(BUN)和肌酐(SCr)含量,评估肾功能[5];制作肾脏石蜡切片,进行HE染色,并用正置荧光显微镜观察肾脏病理变化情况;用DHE及MitoSOX荧光探针对肾脏冰冻切片进行染色,激光共聚焦观察肾组织ROS水平;免疫印迹检测大鼠肾脏组织SOD1、SOD2、GPx-1、CAT、Bax、Bcl-2以及GRP78蛋白的表达。【结果】1、镉暴露可使大鼠食欲减退、皮毛粗糙、情绪暴躁,体重增长减缓,不同剂量镉暴露大鼠肾脏脏器系数无显著差异(P>0.05),全血以及肾皮质中镉蓄积明显,不同时间点全血中镉含量随染毒剂量增加而逐渐增加(r=0.908、0.812、0827,P均<0.05),肾皮质中的镉含量随染毒剂量增加也逐渐增加,(r=0.849、0.821、0.944,P均<0.05)。随染毒时间延长,大鼠全血中镉含量未有明显改变(P>0.05),肾皮质中镉含量逐渐增加(P>0.05)。2、镉暴露后大鼠肾小球及肾小管出现病理性损伤,且随着CdCl2染毒剂量增加和时间延长,肾脏病理损伤进行性加重,直至结构完全破坏。超微结构观察显示,镉暴露可导致肾小球系膜细胞线粒体肿胀变圆;肾小管上皮细胞损伤,尤其是线粒体严重损伤,随CdCl2染毒剂量的增加和时间的延长损伤程度进行性加重。全自动生化仪测定血清中尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)的含量显示,Cd暴露可使大鼠肾功能受损,但改变无明显趋势。3、低硒(0.05 mg/kg Na2SeO3)和高硒(0.1 mg/kg Na2SeO3)干预3M时镉暴露大鼠肾脏脏器系数有下降趋势,硒干预有提高肾脏脏器系数的趋势,但差异无统计学意义(P均>0.05)。病理结果显示:同对照组相比,0.05Se组出现肾小管损伤,且损伤随时间延长进行性加重,0.1Se组早期出现肾小球损伤,随时间延长肾小球损伤逐渐减轻但肾小管扩张加重。硒干预后,0.05Se+5Cd组早期肾小球肿胀明显缓解,间质充血有所减轻,随时间延长,肾小球情况继续好转,但肾小管出现扩张且程度逐渐加重。而0.1Se+5Cd组肾小球损伤未改善且随时间延长肾小球和肾小管损伤均加重。超微结构观察显示:0.05Se+5Cd组对肾组织病理损伤改善作用有限,但能显著改善镉暴露引起的肾组织超微结构尤其是线粒体的损伤。0.1Se+5Cd组对单纯镉暴露导致的肾小球超微结构损伤有一定改善,但对肾小管上皮细胞的线粒体损伤未有改善,且出现髓鞘样结构和内质网扩张。4、随镉暴露时间延长,剂量增加,肾组织的ROS水平逐渐升高。镉暴露1M时,大鼠肾组织中的抗氧化酶SOD2、GPx-1和CAT表达增加,与染毒剂量呈正相关(r=0.854、0.975、0.918,P均<0.05),SOD1表达减少,与染毒剂量呈负相关(r=-0.987,P<0.05);肾组织凋亡相关分子Bax/Bcl-2也呈剂量依赖性升高(r=0.83,P<0.05);同时,内质网应激标志蛋白GRP78的表达也随CdCl2剂量增加而升高(r=0.913,P<0.05)。5Cd组、0.05Se+5Cd组和0.1Se+5Cd组的大鼠全血和肾皮质中的镉含量均明显高于Con组(P均<0.05)。0.05Se+5Cd组和0.1Se+5Cd组与5Cd组相比全血中的镉含量未有明显改变(P>0.05)。而肾皮质中的镉含量0.05Se+5Cd组与5Cd组相比明显增加(1M、3M P均<0.05,2M时P>0.05),0.1Se+5Cd组与5Cd组相比镉含量虽增加但无统计学差异(P>0.05)。与对照组相比,0.05Se组的肾组织ROS水平无明显变化,而0.1Se组线粒体内的ROS明显增加。低硒可抑制镉(5Cd组)引起的细胞内ROS升高(1M时),但对线粒体内ROS水平升高无明显作用,高硒对镉(5Cd组)引起的细胞内及线粒体ROS升高均无明显作用。【结论】1、慢性镉暴露致大鼠肾损伤模型的建立5 mg/kg CdCl2灌胃3个月可以建立较为理想的慢性Cd暴露致大鼠肾损伤模型。Cd暴露造成的大鼠肾脏结构和功能的损伤具有剂量和时间依赖性,损伤程度与肾组织中的Cd含量相关。2、低硒干预可保护镉诱导的大鼠肾损伤,高硒干预则加重肾损伤硒干预对Cd致大鼠肾损伤的影响情况与Se剂量有关。低硒(0.05 mg/kg Na2SeO3)干预能显著改善镉诱导的大鼠肾组织损伤。而高硒(0.1 mg/kg Na2SeO3)干预明显加重单纯镉暴露导致的肾组织病理损伤和肾小管超微结构损伤,且肾小管上皮细胞线粒体为主要损伤靶点。3、氧化应激、线粒体损伤和内质网应激可能是镉暴露致肾损伤的机制Cd暴露导致肾组织ROS水平升高,引起氧化应激,肾小管上皮细胞线粒体剂量和时间依赖性损伤,内质网应激发生。4、高硒干预加重镉诱导大鼠肾损伤的机制可能是氧化还原紊乱高硒干预可以显著增加肾脏镉蓄积量,未能抑制镉引起的肾组织ROS水平升高,且单纯硒暴露即可促进ROS产生。提示硒和镉共同处理可能导致氧化还原紊乱,造成肾组织损伤。