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趋化因子是一组由70-90个氨基酸组成的小分子蛋白质(8-14kDa)。趋化因子及其受体在生理及病理情况下对白细胞间信息交流及移行起着至关重要的作用,调控着白细胞在血管、淋巴及其它组织、器官间的迁移和募集。自1996年发现趋化因子受体CCR5和CXCR4是HIV-1感染人T淋巴细胞的协同受体后,对趋化因子及其受体的研究不断深入。目前已知趋化因子及其受体所介导的生物学作用不仅限于炎症范畴,它们在免疫系统分化成熟、免疫监视、免疫自稳、造血生成、机体发育及HIV-1感染等过程中发挥重要的调节作用。尽管趋化因子及受体对机体发挥广泛的生物学作用;但在生殖免疫领域有关功能作用尚待研究探讨。母体免疫系统不排斥作为半同种移植物的胎儿,是免疫生物学的唯一例外。母-胎免疫耐受不仅发生于母体系统免疫;更发生于母-胎界面。早孕期蜕膜组织中的免疫活性细胞组成极其独特,其中70%以上的细胞为CD56brightCD16?NK细胞,其余为T细胞(~10%)及巨噬细胞(~15%)。相反,外周血淋巴细胞中则仅有10%为NK细胞,其中CD56brightCD16?NK又仅占NK细胞总数的10~15%。众多证据表明,蜕膜CD56brightCD16?NK细胞从外周被募集而来;并非由其前体细胞在蜕膜局部自我更新所致。然而,有关外周CD56bright CD16?NK细胞被高特异性募集至蜕膜的确切机制却知之甚少。由于趋化因子及受体的相互作用在淋巴细胞的迁移、募集和归巢中起着决定性的作用,因此CD56bright CD16?NK细胞募集至蜕膜局部,极可能涉及趋化因子受体及配体的相互作用。CD56bright CD16?NK细胞可能表达独特的趋化因子受体谱;母-胎界面存在相应的趋化因子与CD56bright CD16?NK细胞高表达的趋化因子受体相互作用,使外周CD56bright CD16?NK细胞循趋化因子浓度梯度特异性募集至蜕膜局部。趋化因子不仅能募集各类淋巴细胞,还能趋化某些恶性肿瘤细胞及上皮细胞,同时调控细胞的生物学行为,如促进细胞分化与增殖、介导靶细胞移行。来自于滋养外胚层(trophectoderm)的早孕滋养细胞是唯一与母体免疫系统直接接触的<WP=9>胎儿细胞,具有独特的生物学特性,如类似恶性肿瘤细胞的侵袭能力。蜕膜局部分泌的趋化因子可能起着招募滋养细胞的作用,使滋养细胞特异性趋化至蜕膜局部。早孕滋养细胞具有高增殖能力,母-胎界面表达的趋化因子可能以自分泌、旁分泌方式调控滋养细胞增殖及分化。研究母-胎界面趋化因子及受体的表达,可进一步揭示趋化因子及其受体在母-胎界面的生理功能,为阐明复杂的妊娠机制提供有价值的信息。此外,分析 HIV-1入侵靶细胞的协同受体CXCR4及CCR5及其相关趋化因子在滋养细胞的表达,有助于阐明HIV-1经子宫垂直传播的分子机制。本研究拟通过如下实验研究,以解析趋化因子及其受体在母-胎界面的生物学调控作用:1. 早孕期绒毛细胞滋养细胞(VCT)和绒毛外细胞滋养细胞(EVCT)的分离、培养及鉴定应用不同胰酶消化步骤,收集人早孕期绒毛组织的VCT及EVCT并分别培养。应用倒置显微镜、扫描电镜观察VCT及EVCT的形态学特征;免疫细胞化学鉴定细胞来源及纯度。结果显示胰酶短期、温和消化获得的EVCT,可生长于Matrigel上,并表达特异性标志物c-crbB-2。延长消化时间、增加胰酶浓度获得的VCT,种植于塑料或玻璃培养器皿上,可聚集并融合形成合体滋养细胞。VCT不表达c-erbB-2。因此采用不同的胰酶消化及体外培养条件,可简单、快速获得高纯度人早孕期VCT及EVCT。趋化因子受体和配体在早孕期人滋养细胞的表达及其生物学功能首先分离早孕期人滋养细胞,RT-PCR系统检测了18种趋化因子受体在滋养细胞的转录水平,并筛选出普遍高水平转录的趋化因子受体(CXCR4,CXCR6)。免疫细胞化学和免疫组化证实早孕期人滋养细胞可翻译CXCR4。MTT实验揭示外源给予及滋养细胞自分泌的 SDF-1具有促滋养细胞增殖效应;而PD98059则能拮抗外源SDF-1的促增殖效应。Western blot 证实 SDF-1显著增加滋养细胞内ERK1/2磷酸化水平。本研究表明,早孕期人滋养细胞表达SDF-1/CXCR4,该趋化因子配体、受体对相互作用,诱导细胞内ERK1/2磷酸化,从而以自分泌、旁分泌方式促进滋养细胞增殖。3. 早孕期人蜕膜CD56brightCD16?NK细胞趋化因子受体表达及特异性募集机制收集早孕期蜕膜组织,免疫磁珠分选CD56brightCD16?NK细胞;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测CD56brightCD16?NK细胞中18种趋化因子受体的转录水平,筛选出高表达趋化因子受体(即CXCR4及CXCR3)。原位杂交及免疫组化分析CXCR4特异性配体SDF-1在早孕胎盘的定位表达;ELISA检测早孕滋养<WP=10>细胞培养上清液中SDF-1α的浓度水平。趋化试验研究重组人SDF-1α(rhSDF-1α)及滋养细胞培养上清液对蜕膜CD56brightCD16?NK细胞的趋化作用。研究结果表明人早孕期蜕膜CD56brightCD16?NK细胞高水平转录CXCR4,而滋养细胞则表达并分泌CXCR4的配体SDF-1。SDF-1趋化、募集CD56brightCD16?NK细胞至蜕膜局部,从而有助于形成蜕膜独特的免疫微环境;通过滋养细胞其他分子(如HLA-G)训导蜕膜NK细胞,以维持母-胎免疫耐受。4. HIV-1协同受体及相关趋化因子在人胎盘组织的表达及可能的作用 半定量RT-PCR检测早、中、晚孕期胎盘及早孕滋养细胞CXCR4、CCR5 mRNA水平;免疫组化和免疫细胞化学?