番茄(Lycopersicume sculuentum Mill),又名西红柿,茄科,果肉柔软多汁,常用作蔬菜或水果,具有较高的食用价值,是世界上重要的农作物之一,同时也是最先用于转基因研究的植物,在科学研究中处于重要地位。番茄果实成熟机制属于呼吸跃变型,即在果实成熟过程中伴随有呼吸峰和乙烯的大量生成。果蔬采后最主要的生命活动过程就是呼吸,采后的呼吸特性和状况直接影响到果蔬的耐贮性和抗病性,是品质劣变与腐烂的原因之一。提高番茄果实的耐贮性是番茄育种的一个重要目标。近年来,在对番茄果实成熟的分子机制的研究的基础上,通过成熟突变基因和基因工程对番茄果实的耐贮性进行遗传改良获得了显著效果。但这些研究以ACC氧化酶(ACO)、ACC合成酶(ACS)和RIN、NOR、GR基因为主要对象,对于与果实细胞壁降解密切相关的一些酶的研究还比较少。费章君等(2004)建立了一个番茄的EST库,其中包含了超过150000个独立的EST序列,代表了大约30000个独立的基因,并结合公布的基因芯片表达数据获得了大量的基因表达数据。根据他们的研究结果,费老师告诉我们有一些候选基因有可能在番茄果实成熟过程中起重要作用,因此我们设计实验,根据公布的序列信息,将其中的两个可能在果实成熟中发挥重要作用的基因分离出来,并利用半定量和定量PCR的方法,研究这两个基因在番茄成熟过程中的表达情况。主要结果和结论如下:1采用RT-PCR方法克隆了两个候选基因的cDNA片段根据GenBank中已经公布的基因序列,用“primer 5.0”软件设计基因特异引物,以破色期番茄cDNA为模版,进行PCR扩增目的基因片段,得到大小均为1.2kb的目的片段。所得核苷酸序列通过Blast分析发现,编号为TC115905的EST片段与苹果(Malus x domestica)果胶酸裂解酶(pectate lyase)高度同源,对其编码的蛋白质进行系统树的分析发现其属于果胶酸裂解酶(pectate lyase)超家族,因此暂定名为LePelC;另一个EST片段TC124194编码的氨基酸的同源分析发现它与矮牵牛的PHAP2A有57%的同源性,并且具有AP2保守结构域,暂定名为LeAPETALA2LIKE。2通过半定量PCR和定量PCR方法研究候选基因在番茄果实成熟过程中的作用利用17个处于不同发育时期的番茄果实的cDNA为模版,进行半定量PCR和定量PCR的研究,发现LEPelC在果实发育初期就有一定基础水平的表达,但在授粉后25天时,它的表达突然增加,在授粉后28日处就达到很高的水平,其后表达水平有所下降,但表达水平仍远大于授粉后25日以前的水平,定量PCR的结果进一步揭示了它在果实发育中的表达水平,结果显示在授粉后25日之后非常之高,这与此基因编码产物为果胶酸裂解酶(pectate lyase)的推论相一致。另一方面,番茄LeAPETALA2LIKE基因的表达情况也与LEPelC的表达情况类似,我们可以看到此基因的表达也是伴随着番茄的呼吸跃变出现了表达的突然增加,并且此基因在果实发育的前期也有一基础水平的表达,但比较LEPelC的表达情况而言,此基因的表达水平远不如前者高。这与该基因编码APETALA2类似蛋白的推论一致,此基因并不是影响果实成熟的关键基因。根据研究的结果,认识到这两个基因在果实成熟过程中的表达模式,为了进一步研究他们的功能,我们还分别构建了这两个基因的正义和反义表达载体,并转入农杆菌EHA105,以便于进一步的功能研究。