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本实验室前期研究发现:在骨癌痛(bonecancerpain,BCP)大鼠模型中,钠钾氯联合转运体-1(sodium-potassium-chloride cotransporter 1,NKCC1)和钾氯共转运体-2(potassium-chloride cotransporter 2,KCC2)通过调节细胞内 Cl-浓度,影响 γ-氨基丁酸(y-aminobutyric,GABA)受体的抑制性功能并参与骨癌痛的发生、发展。最新研究显示:病理状态下,赖氨酸缺陷蛋白激酶-1(with-nolysine kinases 1,WNK1)通过SPAK和OSR1蛋白途径,调节NKCC1/KCC2表达,从而影响细胞内Cl-浓度。据此,我们推测WNK1-SPAK/OSR1-NKCC1/KCC2信号转导通路可能参与骨癌痛,但未见相关报道。本研究拟建立大鼠骨癌痛模型,首先观察WNK1及其下游蛋白在BCP大鼠脊髓背角(dorsal horn,DH)和背根神经节(dorsalroot ganglion,DRG)中的表达,然后使用siRNA技术抑制WNK1,观察其下游蛋白的表达以及对BCP大鼠疼痛行为学的影响,进而采用神经药理学的方法研究WNK1-SPAK/OSR1-NKCC1/KCC2信号转导通路是否参与BCP的过程。本研究将丰富癌痛机理,为癌痛治疗药物的研发提供新思路。第一部分:WNK1在骨癌痛大鼠脊髓背角和背根神经节中的表达目的探讨WNK1激酶在骨癌痛大鼠脊髓DH和DRG中的表达变化方法将乳腺肿瘤Walker256细胞株注射于大鼠的左后肢胫骨干骺端,建立大鼠骨癌痛模型。雌性SD大鼠,随机分为正常对照组(control组,n=5)、假手术组(sham组,n=5)、骨癌痛组(BCP组,n=20);其中control组大鼠不做任何处理,sham组大鼠在左后肢胫骨干骺端注射10μl Hank’s液,BCP组大鼠则注射Walker256乳腺癌细胞(1× 105/10μl Hank’s);control组和sham组在观察第12天处死大鼠,BCP组在造模后3、6、9、12d分别处死5只大鼠,并提取L4-6脊髓及相应节段DRG。通过疼痛行为学、实时荧光定量PCR、免疫荧光及Western Blot方法进行以下研究:1、观察BCP大鼠疼痛行为学;2、观察WNK1在BCP大鼠脊髓DH和DRG上的表达变化;3、研究WNK1激酶在BCP大鼠脊髓DH和DRG上的表达分布及细胞定位。结果1、分别比较control组和sham组,BCP组大鼠机械缩足反射阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)在建模后第 6 天开始显著降低(P<0.01),并持续至第12天;2、比较sham组,建模后第6天开始WNK1 mRNA和蛋白在骨癌痛大鼠脊髓DH和DRG中表达上调(P<0.01或0.05);3、免疫荧光显示:大鼠骨癌痛时,表达上调的WNK1广泛分布在脊髓背角(骨肿瘤同侧)Ⅰ-Ⅳ层,并主要集中于脊髓DH的Ⅰ-Ⅱ层以及DRG上;4、免疫荧光双标染色显示,WNK1主要表达于脊髓DH和DRG的神经元细胞上。结论骨癌痛大鼠脊髓DH和DRG的WNK1激酶表达水平明显上调。第二部分:鞘内注射WNK1 siRNA对大鼠骨癌痛的影响目的观察鞘内注射WNK1 siRNA对大鼠骨癌痛的影响方法体外合成并筛选针对WNK1的siRNA(siWNK1)。雌性SD大鼠,随机分为假手术组(sham组,n=10)、假手术+siWNK1组(sham+siWNK1组,n=5)、骨癌痛组(BCP 组,n=10)、骨癌痛+siWNK1(BCP+siWNK1 组,n=10)、骨癌痛+载体(BCP+vehicle 组,n=10)、骨癌痛+scrambled 组(BCP+scrambled 组,n=10);其中,sham+siWNK1组和BCP+siWNK1分别在造模后的第9-11天连续鞘内注射siWNK13μg+jetPEI 0.36μl+0.5%GS 10μl,BCP+vehicle 组则连续鞘内注射 jetPEI 0.36μl+0.5%GS 1 0μl,BCP+scrambled 组则连续鞘内注射阴性 siRNA3 μg+jetPEI 0.36μ1+0.5%GS 1 0μl,sham组和BCP组处理同第一部分;除sham+siWNK1组外,各组第12天处死5只大鼠,提取L4-6节段脊髓DH和DRG。通过疼痛行为学、实时荧光定量PCR、免疫荧光及Western Blot方法进行以下研究:1、合成并筛选针对WNK1的siRNA,并评估其抑制率及细胞毒性;2、观察鞘内注射siWNK1后,BCP大鼠的疼痛行为学;3、鞘内注射siWNK1后,分别在BCP大鼠的脊髓DH和DRG观察WNK1及其下游的SPAK/OSR1、NKCC1/KCC2蛋白的表达变化。结果1、化学合成的siWNK1可以高效抑制PC12细胞上WNK1的表达,且无明显的细胞毒性;2、与BCP组比较,BCP+siWNK1组大鼠PWMT值升高(P<0.05),并明显降低肢体使用指数(limb use score)(P<0.01);3、与BCP组比较,BCP+siWNK1组大鼠脊髓DH和DRG的WNK1 mRNA水平明显降低(P<0.01),同时伴随WNK1蛋白免疫荧光强度的减小(P<0.01);4、与BCP组比较,BCP+siWNK1组大鼠DRG中NKCC1 mRNA和蛋白的表达显著降低(P<0.01),而在脊髓DH中无显著变化;5、与BCP组比较,BCP+siWNK1组大鼠脊髓DH中KCC2 mRNA和蛋白的表达明显升高(P<0.01);6、与 BCP 组比较,BCP+siWNK1 组大鼠 DRG 中 SPAK/OSR1 蛋白的表达降低(P<0.01),而在脊髓DH中无显著改变。结论鞘内注射siWNK1可明显缓解BCP大鼠的骨癌痛,同时部分抑制WNK1下游的SPAK/OSR1、NKCC1/KCC2蛋白在脊髓DH或DRG的表达。第三部分:鞘内注射Closantel对大鼠骨癌痛的影响目的观察鞘内注射Closantel对大鼠骨癌痛的影响方法雌性SD大鼠,180-200g,随机分为假手术组(sham组,n=10)、假手术+Closantel 组(sham+Closantel 组,n=5)、骨癌痛组(BCP 组,n=10)、骨癌痛+载体(BCP+vehicle 组,n=10)、骨癌痛+Closantel 组(BCP+Closantel 组,n=10);其中,sham+Closantel组和BCP+Closantel组在造模后的第9-11天连续三天鞘内注射Closantel(SPAK/OSR1 抑制剂)60μg/10μl DMSO,BCP+vehicle 组连续鞘内注射 10μl DMSO,sham组和BCP组处理同前;除sham+Closantel组外,各组第12天处死5只大鼠,提取L4-6节段脊髓DH和DRG。通过疼痛行为学、实时荧光定量PCR、免疫荧光及Western Blot方法进行以下研究:1、观察鞘内注射Closantel后,BCP大鼠的疼痛行为学;2、鞘内注射Closantel后,分别在BCP大鼠的脊髓DH和DRG观察NKCC1/KCC2蛋白的表达变化;3、鞘内注射Closantel后,在BCP大鼠DRG观察SPAK/OSR1和NKCC1/KCC2蛋白的相应表达情况。结果1、与BCP组比较,鞘内注射Closantel后BCP+Closantel组大鼠PWMT值明显上升(P<0.05),并明显降低肢体使用指数(limb use score)(P<0.01);2、与BCP组比较,鞘内注射Closantel后,BCP+Closantel组大鼠NKCC1 mRNA和蛋白在DRG中的表达明显降低(P<0.01),而在脊髓DH中无显著改变;3、与BCP组比较,BCP+Closantel组大鼠在脊髓DH中KCC2 mRNA和蛋白的表达明显上调(P<0.01);4、免疫荧光显示,NKCC1和SPAK/OSR1共表达于大鼠DRG,与BCP组比较,鞘内注射 Closantel 后 BCP+Closantel 组大鼠 DRG 中 SPAK/OSR1 和 NKCC1 的免疫荧光强度显著减少(P<0.01)。结论鞘内注射Closantel可明显缓解BCP大鼠的骨癌痛,同时抑制SPAK/OSR1-NKCC1在DRG中的表达和KCC2在脊髓DH中的表达。第四部分:NKCC1/KCC2表达对大鼠骨癌痛的影响目的探讨骨癌痛大鼠NKCC1/KCC2的表达及其变化对骨癌痛的影响方法雌性SD大鼠,随机分为5组:假手术组(sham组,n=10)、骨癌痛组(BCP组,n=10)、骨癌痛+溶媒组(BCP+vehicle 组,n=10)、骨癌痛+CLP257 组(BCP+CLP257组,n=5)、骨癌痛+bumetanide 组(BCP+bumetanide 组,n=5)。sham 组大鼠于左后肢胫骨干骺端注射10μl Hank’s液,BCP组大鼠则注射Walker256乳腺癌细胞(1×105/10μl Hank’s)。其中,在造模后的第9、10、11天,BCP+vehicle组鞘内注射DMSO 10μl;BCP+CLP257 组鞘内注射 CLP257(KCC2 激动剂)100μg/10μl DMSO;BCP+bumetanide 组鞘内注射 bumetanide(NKCC1 选择性抑制剂)100μg/10μlDMSO。造模后第12天,各组处死大鼠,分别提取脊髓DH和DRG。通过疼痛行为学、实时荧光定量PCR、Western Blot方法进行以下研究:1、观察鞘内注射bumetanide对骨癌痛大鼠疼痛行为学的影响及NKCC1表达的变化;2、观察鞘内注射CLP257对骨癌痛大鼠疼痛行为学的影响及KCC2表达的变化。结果1、比较BCP组,BCP+bumetanide组大鼠在鞘内给予bumetanide后的1-4h,其PWMT值升高(P<0.05或0.01),肢体使用指数(Limbusescores)减小(P<0.01),同时BCP+bumetanide组大鼠DRG中NKCC1蛋白表达显著降低(P<0.01);2、比较BCP组,BCP+CLP257组大鼠在鞘内注射CLP257后2-4h,其PWMT值升高(P<0.05),Limb use scores减小(P<0.01),同时BCP+CLP257组大鼠脊髓DDH中KCC2蛋白表达明显上调(P<0.01)。结论NKCC1/KCC2参与骨癌痛过程,且NKCC1/KCC2表达变化影响BCP大鼠机械痛阈。