几丁质是地球上含量仅次于纤维素、位居第二的碳水化合物,而真菌所分泌的几丁质酶可将几丁质水解,最终产物为N-乙酰-β-D-葡萄糖胺（N-Acetyl-β-D-Glucosamine,NAG）。由于采用传统化学方法降解几丁质耗时、难度大、成本高、污染严重,而采用生物降解不仅有效克服了上述问题,还可提高资源利用、增加经济效益,因此被广泛应用在农业、医药、化工、食品、环境等诸多领域。尽管已经分离了许多种几丁质酶,相关的基因也已克隆和表达,但有关热稳定性几丁质酶的研究却很少。目前仅从极端耐热古细菌Thermococcus chitonophagus、Thermococcus kodakaraensis KOD1以及细菌Bacillus BG-11、Streptomyces OPC520等中分离到热稳定几丁质酶基因,而真菌中除了本实验室报道的来源于嗜热真菌疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）的热稳定几丁质酶基因外,未见其它报道。嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）广泛分布,生长上限温度较高,从该真菌中已分离得到多种嗜热酶,但未见嗜热几丁质酶的报道。本研究中C. thermophilum在以胶状几丁质为唯一碳源的合成培养基中诱导产生了胞内几丁质酶。根据真菌几丁质酶的氨基酸同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR及快速扩增cDNA末端（RACE）的方法,克隆了嗜热毛壳菌C. thermophilum热稳定几丁质酶chit基因,cDNA序列全长为1209bp,包含一个开放阅读框,编码402个氨基酸。该基因已在Genbank中注册,登录号为EU697741。同时提取出嗜热毛壳菌C. thermophilum基因组DNA,克隆了该酶的部分DNA序列,获得的序列长1263bp,包含一个内含子区域。该基因在GenBank中注册号为EU697742。由核苷酸序列推测的相应氨基酸序列结构包括催化区,无N端信号肽序列、几丁质结合区和富含丝苏氨酸区。比较几丁质酶的催化区序列,发现与18家族几丁质酶的催化区同源性很高,其中两个基序S-GGW和DG-D-DWE非常保守,这两保守基序与糖基水解酶（glycosylhydrolases）18家族催化活性有关,其中不变氨基酸残基Asp和Glu为几丁质酶的催化活性位点,因此该酶应属于几丁质酶18家族。还利用在线软件预测了该蛋白质的糖基化位点和三级结构。并对该基因的系统发育作了初步分析。将chit基因与酵母表达载体pPIC9K经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,体外连接构建了酵母分泌型表达载体pPIC9K/chit,将重组表达质粒pPIC9K/chit和pPIC9K空质粒分别用限制性内切酶SacⅠ（位于5’AOX1区内）线性化后,采用电击法转化巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115感受态细胞,于MD/MM平板上筛选His+Mut+表型的酵母转化子。经过PCR检测及G418抗性筛选多拷贝整合子,进行甲醇诱导培养。通过检测各转化子每隔24h的蛋白表达情况来筛选高效表达目的几丁质酶的工程菌株。经过检测与筛选获得了转酵母工程菌株GS-CH-4,检测遗传稳定性,并测定了几丁质酶CHIT的酶学性质。酵母工程菌株GS-CH-4在YPD平板上划线,连续传代8次后,PCR检测呈阳性,重组几丁质酶的表达量基本保持稳定。表达几丁质酶CHIT的最适反应温度和pH分别为60℃和5.5,该酶在50℃以下稳定;65℃的半衰期为40min,由此可见该表达几丁质酶具有热稳定性,且在pH值为2.0～6.0之间表达几丁质酶保持稳定的酶活性;Ba2+、Fe2+对酶有激活作用,一些重金属离子Ag+、Hg2+对酶有显著的抑制作用。C. thermophilum几丁质酶能在毕赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白,而且表达产物具有优良特性,这就预示了表达几丁质酶在几丁质工业和生物学领域的广阔应用前景。因此,期望能对该基因进行改造,或进一步优化表达条件,获得真正有工业应用价值的酵母工程菌株。