研究背景:脑梗死是神经内科的常见疾病,腔隙性脑梗死是其中重要的一型。腔隙性脑梗死是指影像学上直径介于3-15mm的脑内缺血性病灶,在老年人群尤其是60岁以上的老年人群中发病率高,是脑梗死的常见类型,约占脑梗死所有类型的1/4左右,也是中国人常见的卒中类型。腔隙性脑梗死的病因通常被认为是脑小血管病,以往的研究显示,腔隙性脑梗死的动脉病理改变可能为小动脉玻璃样变、小动脉硬化、脑血流量减少、动脉痉挛、血管内皮功能异常等。造成这些病理表现的原因往往是动脉高血压。但是近年来的研究发现,造成腔隙性脑梗死的病因不仅仅是小动脉病,大动脉粥样硬化导致分支动脉闭塞供血障碍或微栓脱落导致动脉到动脉的栓塞并不少见。Notch3基因对血管的发育与出生后的血管新生十分重要。Notch3基因也与表皮细胞、骨骼、血液细胞、肌肉细胞及内皮细胞的分化有关。Notch3基因的突变导致伴皮层下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性动脉病(cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukocephelopathy,CADASIL),其病理表现主要为Notch3蛋白沉积在血管平滑肌细胞上,导致皮肤尤其是脑的小血管病变。单核苷酸多态性(single nucleotides polymorphisms,SNPs)是基因多态性最常见的类型,在Notch3基因上有许多SNPs,这些SNPs有的也可造成氨基酸改变,这些变异是否会影响Notch3信号通路,是否与缺血性脑血管病及大动脉粥样硬化的发生发展有关尚不清楚。目前已认识到,部分腔隙性脑梗死可以由大动脉粥样硬化或大动脉粥样硬化所致。近年的研究也认识到遗传因素在脑梗死的发病中有重要作用,已有多个单基因病与脑梗死有关,这些单基因病可造成腔隙性脑梗死症状,如CADASIL、伴皮层下梗死和白质脑病的常染色体隐性遗传性动脉病(cerebral autosomal recessive arteriopathy with subcortical infarcts and leukocephelopathy,CARASIL)、脑淀粉样血管病、镰状细胞病等,均可造成腔隙性脑梗死的发生。多基因相互作用也可能增加缺血性脑血管病的风险,如MTHFR 677TT,ALOX5AP 2354AA和Notch3 381TT/TC的联合突变可导致缺血性脑血管病风险增加。由于腔隙性脑梗死的临床症状相对较轻,有可能使病人和家庭放松了对腔隙性脑梗死的一级预防及二级预防,但研究发现腔隙性脑梗死病人再发脑卒中的比例并不低,而且皮层下灰质的多发性腔隙性脑梗死与血管性痴呆的发生有相关性,如果能尽早了解腔隙性脑梗死的病因,找到与发生腔隙性脑梗死或腔隙脑梗死再发脑卒中相关的危险因素,包括血管危险因素或与基因相关的危险因素,有可能减少脑梗死的发病率及残疾率。为了解腔隙性脑梗死的危险因素,尤其是颅内外大动脉粥样硬化及notch3基因snps与腔隙性脑梗死的关系,我们对自2010年3月至2011年12月在我院神经内科住院的腔隙性脑梗死病人的梗死部位、数量、危险因素及是否合并颅内外动脉粥样硬化纳入研究并进行统计,并对其中部分知情同意的病人进行了notch3基因多态性的研究,试图了解腔隙性脑梗死与大动脉粥样硬化及notch3基因snps之间的关系,以及notch3基因snps与大动脉粥样硬化之间是否具有相关性。病例、材料和方法:1.病例来源:回顾性分析2010年3月至2011年12月期间在我院神经内科住院的、以脑梗死、短暂性脑缺血发作(transientischemiaattack,tia)和后循环缺血为第一诊断的病例,其中脑影像学上证实有腔隙性脑梗死的病例纳入研究。另有同期住院的无任何脑梗死的病人作为对照。2.数据采集:所有入选病人均行头颅ct或头颅mri影像学检查证实是否存在腔隙性脑梗死或无任何类型的梗死;腔隙性脑梗死定义为直径介于3-15mm的缺血病灶。病史的采集包括:高血压病史、糖尿病史、高脂血症史、心脏疾病史、吸烟、饮酒史;入院后第一天的血压、血糖、血脂检测以明确未诊治的高血压、糖尿病及高脂血症;入院后的颈动脉超声、脑动脉mra或cta检查。其中部分经知情同意的腔隙性脑梗死病人及无脑梗死病灶的对照人群行notch3基因外显子3-6的snps筛查。3.pcr过程:采集经知情同意的病人的全血,利用dna提取试剂盒(tiangen)提取人全血dna,将获得的人dna经凝胶电泳鉴定后贮存于-20°c,备用。请基因公司(华大基因公司,北京)设计引物,将提取的dna行聚合酶链反应(polymerasechainreaction,pcr)pcr反应仪geneamppcrsystem2400,以pcr扩增的方式对感兴趣的区域进行合成扩增,获得notch3基因外显子3-6的序列,3-4外显子的上游引物为5’-gtttgctgctctgtttccctg-3’,下游引物为5’-ggcacagtcgtaagtgaggt-3’。pcr反应条件为95°c*10分钟;94°c*30秒共36个循环;65°c*1分钟;72°c*10分°c钟。产物为656个碱基对。5-6外显子为反向测序,上游引物为5’-agaaaacggccactcaccag-3’,下游引物为5’-acaccgatgtctcaatgggg-3’。pcr反应条件为95°c*10分钟;94°c*30秒共36个循环;55°c*1分钟;72°c*10分钟,产物为415碱基对。4.基因分析:以直接测序(重庆genemine公司)的方法对pcr产物进行测序,用genetools软件阅读分析序列并与snp数据库比对,分析出其中的snps。核苷酸序列从美国国立生物科技信息中心(nationalcentreforbiotechnologyinformation,ncbinucleotide)数据库获得。snp数据从ncbi的snp数据库获得(www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)。5.数据统计:采用spss16.0分析软件进行统计,腔隙性脑梗死与对照组间各危险因素的比较采用χ2检验;如果方差不齐,采用fisher精确检验;年龄比较采用独立样本t检验;各危险因素与腔隙性脑梗死之间的相关性采用多因素回归分析;腔隙性脑梗死与对照组基因型之间的比较采用χ2检验;各危险因素及大动脉粥样硬化与腔隙性脑梗死之间的关系采用单因素及多因素回归分析;notch3snp与腔隙性脑梗死及大动脉粥样硬化之间的关系采用相关性分析;两组间的平均年龄及等位基因频率采用独立样本t-检验。显著性差异定义为p<0.05。结果:我们的研究共纳入腔隙性脑梗死病人276例,无任何脑梗死的对照118例。两组年龄及性别比例分别为:68.9±10.9和58.9±10.2;139(50.4%)和53(44.9%)。腔隙性脑梗死的最常见部位是基底节区(143例,51.8%)和侧脑室旁(100例,36.2%),腔隙性脑脑梗死的危险因素仍为高血压(两组分别为73.2%和46.6%)、糖尿病(两组分别为30.8%和21.2%)和高脂血症(两组分别为55.1%和50.0%);腔隙性脑梗死病人中颅内、外大动脉粥样硬化并不少见;相关性分析发现,年龄(or:1.803,ci%1.056-1.112)、高血压(or:4.053,ci%2.421-6.787)、颅内动脉粥样硬化与腔隙性脑梗死有显著的相关性;颅内动脉粥样硬化与腔隙性脑梗死的相关性在调整年龄和性别前后分别为or:4.141;95%ci:2.451-6.997和or:3.103;95%ci:1.707-5.640,心脏疾病在两组病人中发病率低,与腔隙性脑梗死无相关性。共有105例腔隙性脑梗死病人及30例对照人群进行了notch3基因测序,基因分析发现,notch3基因3-6号外显子有多个snps,但仅snprs1043994及rs3815388有较多的等位基因频率而纳入统计分析。snprs1043994与腔隙性脑梗死有相关性(相关性分析p<0.05),snprs3815188与腔隙性脑梗死无相关性;这两个snp均与颅内外大动脉粥样硬化无显著相关性。结论:腔隙性脑梗死可能是多种危险因素共同作用的结果,Notch3基因SNP rs1043994与腔隙性脑梗死有相关性,SNP rs3815188与腔隙性脑梗死无显著相关性。颅内动脉粥样硬化、年龄、高血压均是腔隙性脑梗死的独立危险因素;两个SNP均与大动脉粥样硬化无相关性;腔隙性脑梗死最易受累的动脉往往在动脉末端或分支动脉;腔隙性脑梗死的病因不仅仅是小动脉病,颅内外大动脉粥样硬化及基因因素在腔隙性脑梗死的发生发展中也起了重要作用。因此,腔隙性脑梗死病人应注意大动脉粥样硬化的防治及基因危险因素。具有危险因素的病人应当更早期的进行基因筛查及血管影像学检查。