论文部分内容阅读
柞蚕(Antheraea pernyi)是鳞翅目大蚕蛾科泌丝昆虫,具有极高的经济价值。柞蚕在野外柞园中饲养,其生长发育过程中容易受到环境中病原微生物的为害而引发柞蚕病害发生,由病原微生物侵染引起的病害造成柞蚕茧产量和质量下降,严重制约了柞蚕产业的健康可持续发展。多数的致病微生物由幼虫口器通过取食进入体内,肠道组织作为第一道免疫屏障有效抵御病原物的侵染。开展柞蚕肠道免疫系统和入侵病原微生物之间相互作用的研究,不仅对阐明柞蚕肠道免疫的分子机制具有重要意义,而且也为柞蚕抗病育种提供理论基础。本研究基于本试验室构建的柞蚕中肠转录组数据库,克隆了柞蚕肽聚糖识别蛋白基因ApPGRP-A,ApPGRP-B,ApPGRP-C,ApPGRP-LE,并结合模式昆虫果蝇和家蚕等数据资源对目的基因进行序列分析,比较四个基因的时空表达模式,以及不用病原物诱导以后识别蛋白基因的免疫应答模式;分析了酰胺酶活性模式识别蛋白对抗菌肽基因表达模式的调控机制。检测并分析微孢子虫(Nosema pernyi)感染柞蚕幼虫以后肠道中活性氧ROS水平变化,比较三个一氧化氮合成酶基因ApNOS1,ApNOS2,ApNOS3时空表达谱和免疫诱导表达模式,研究微孢子虫感染后NO浓度对抗菌肽转录水平的调控作用,研究结果如下:1.克隆得到4个柞蚕肽聚糖识别蛋白基因,分别命名为ApPGRP-A、ApPGRP-B、ApPGRP-C和ApPGRP-LE,核酸序列信息已提交GenBank(登录号:KT725231.1,KT725232.1,KT725233.2,KT725234.1)。基因cDNA全长分别为582 bp,597 bp,627bp,1341 bp,开放阅读框(ORF)编码193,198,208,446个氨基酸。对它们的保守功能域、酰胺酶活性位点、信号肽以及跨膜结构域进行分析。序列分析表明:ApPGRP-A,-B和-C均含有信号肽,其中PGRP-B和-C是具有酰胺酶活性的肽聚糖识别蛋白,序列相似度较高;预测ApPGRP-LE缺少信号肽,属于一种胞内蛋白;4个PGRPs与鳞翅目昆虫的PGRP氨基酸同源性达到51%-70%,均包含一个高度保守的肽聚糖识别蛋白结构域。2.构建4个肽聚糖识别蛋白基因的组织特异性表达谱,结果表明4个ApPGRP在体壁中稳定表达,其中ApPGRP-C在与免疫相关的组织,如血淋巴、体壁、中肠、脂肪体中均有表达;ApPGRP-B在中肠组织中的表达明显高于其他部位;ApPGRP-A,-C和-LE在脂肪体中表达。不同病原物诱导以后,酰胺酶型ApPGRP-B和-C基因表达量短时间内明显升高,并且在肠球菌(E.pernyi)处理以后,表现出显著的诱导效果。为探讨酰胺酶型PGRP对免疫水平的调节作用,利用RNAi技术分别干扰ApPGRP-A,-B,-C,注射siApPGRP-A可以显著降低Attacin、Ceropin、Gloverin、Lebocin和溶菌酶(Lysozyme)免疫诱导作用下的转录水平;注射siApPGRP-B,siApPGRP-C,抗菌肽Attacin、Attacin2、Ceropin、Gloverin、lysozyme基因转录水平明显高于对照组,说明PGRP-B,-C依赖其酰胺酶活性对抗菌肽转录合成具有负调控作用。3.感染微孢子虫N.pernyi后,柞蚕肠道中活性氧ROS含量短时间内显著增高,过氧化氢、一氧化氮的浓度在诱导3 h后分别升高3.49和8.19倍。比较3个一氧化氮合成酶基因(ApNOS1,ApNOS2,ApNOS3)的诱导表达谱,感染微孢子虫3 h后,ApNOS2表达量升高了27.88倍,推测一氧化氮的浓度受诱导型一氧化氮合成酶(NOS2)转录调节;构建3个一氧化氮合成酶基因时空表达谱,结果表明ApNOS1和ApNOS3在血淋巴、马氏管、中肠、生殖腺等组织组成型表达,表达水平随幼虫发育逐渐升高;ApNOS2只在马氏管和生殖腺中表达,微孢子感染诱导其在中肠组织中的表达量显著升高。4.通过体外注射NO供体SNP,外源NO分子能够以胞外信号分子的方式作用于肠道组织,引起中肠一氧化氮含量升高,诱导抗菌肽Attacin、Attacin2、Ceropin、Gloverin、Defensin和Lebocin的转录水平显著升高;注射一氧化氮合成酶抑制剂_L-NAME后,抗菌肽的表达量与对照相比并没有显著差异。对比感染N.pernyi后中肠组织中抗菌肽的表达量发现,N.pernyi+_L-NAME处理组中抗菌肽Attacin、Attacin2、Ceropin、Gloverin的转录水平显著降低;比较N.pernyi+SNP处理和感染N.pernyi处理可以看出,抗菌肽Defensin、Gloverin和Lebocin的转录水平明显升高。以上结果说明柞蚕幼虫食下感染微孢子虫以后中肠组织NO浓度升高,诱导抗菌肽转录合成,NO浓度上调可以促进抗菌肽的转录,增强免疫诱导活性。本课题的开展,在分子水平上研究肽聚糖识别蛋白基因和一氧化氮合成酶基因在柞蚕幼虫各组织及发育时期的表达模式,为探究模式识别蛋白基因和抗氧化基因在柞蚕甚至鳞翅目昆虫中的进化地位和功能多样性提供分子依据和理论基础。同时,还为农业生产中防治鳞翅目害虫提供有利线索。