论文部分内容阅读
早老综合征（Werner syndrome,WS）是一种少见的常染色体隐形遗传疾病,其发病原因是Wrn基因突变所引起的。Dr.Sandy Chang通过双敲除小鼠的端粒酶模板Terc与Wrn基因(mTR-/-wrn-/-,DM),首次成功建立了WS的小鼠模型。实验室在早期研究中发现,来源于WS背景小鼠的肿瘤细胞具有一个相同的p53突变点-p53N236S（简称p53S）,其突变原因是p53 DNA结合区域的第236位天冬酰胺突变为丝氨酸。p53的这种突变是建立在端粒酶缺失的背景下,而端粒酶的主要功能是延长端粒,这说明p53S以端粒损伤为背景。为了研究p53S的功能获得,实验室前期研究将p53S与WS小鼠杂交获得三基因型杂合小鼠,并将三基因型杂合小鼠中mTR-/-基因第一次出现的小鼠称为G1代G1mTR-/-wrn-/-p53SS（G1TM）小鼠,再依次代内杂交获得其它代数小鼠。TM小鼠相比DM小鼠多一个p53S的背景,通过对比研究相同代数的TM、DM小鼠,并通过ChIP-on-chip与RNA-Seq数据分析,获得了MCM（Mini-chromosome maintenance）pathway的相关基因。我们在WS小鼠（DM小鼠）与三基因型小鼠（TM小鼠）的饲养过程中发现,G4、G5代的DM小鼠寿命明显缩短,而G4、G5代TM小鼠寿命相对DM小鼠有所延长,同时,在G1-G3代的TM小鼠身上有不同频率的肿瘤发生现象,由于这种肿瘤细胞中端粒酶活性是阴性的,属于ALT（Alternative lenthing of telomere）肿瘤。我们通过real-time PCR实验对MCM pathway相关基因进行验证,发现G3DM与G3TM、G5DM与G5TM相比较,MCM pathway相关基因的mRNA表达量在相同代数小鼠的TM细胞中高于DM细胞,其中也包括MCM基因。MCM基因转录翻译的MCM蛋白是DNA复制许可因子之一,MCM2-MCM7蛋白通常会形成一个异六聚环型复合物,其主要功能是DNA复制起始的解链和DNA的延伸。本课题主要探究p53S调控DNA复制关键蛋白MCM表达的分子机制。首先,通过real-time PCR和Western blot实验,检测MCM基因在含有p53S（TM）与不含有p53S（DM）的不同代数小鼠细胞中的mRNA水平和蛋白水平,发现在相同代数小鼠的MEF细胞中,TM细胞的mRNA表达量和蛋白表达量都高于DM细胞。随后,鉴于DM与TM小鼠基因背景的复杂性,我们又在p53SS、p53-/-MEF细胞和p53SS、p53-/-肿瘤细胞中验证MCM基因的表达情况,结果发现,MCM在含有p53S的细胞中的mRNA表达量与蛋白表达量均高于不含有p53S的细胞,这表明p53S对MCM基因具有一定的调控作用;通过ChIP实验的验证,发现p53S能够与MCM2基因的启动子区域结合。结合real-time PCR和Western blot实验以及ChIP实验结果,我们得出结论,p53S能够调控MCM2基因,并促进MCM的表达。随后,我们又通过FISH实验来查看这些MCM高表达的细胞的端粒情况,结果发现,在G3代的DM与TM细胞中,都存在端粒的荧光信号;由于G5DM的小鼠是具有早衰表型的小鼠,即正常的G5DM细胞在传代过程中很快就表现出衰老,所以我们在正常的G5DM细胞里几乎没有看见荧光信号,而G5TM细胞能明显看到荧光信号,这提示我们p53S可能通过MCM维持了端粒的长度。最后,我们又在端粒酶缺乏的肿瘤细胞-ALT肿瘤细胞中验证了p53S的调控作用;ChIP实验结果显示,p53S在肿瘤细胞中依然能够结合在MCM2基因的启动子区域,但是,在Western blot实验的结果中显示,只有在G3TM的肿瘤细胞中MCM蛋白有明显的高表达,表明p53S在G3代小鼠的肿瘤细胞中具有明显调控作用。值得注意的是,G1TM与G2TM的肿瘤细胞中MCM的表达量没有明显变化,这可能是由于G1TM、G2TM小鼠本身的端粒长度足够长,还未启动端粒维持机制,这就提示我们,p53S调控MCM的分子机制可能受到端粒长度的影响。我们还通过核型分析查看了ALT肿瘤细胞的染色体情况,结果发现,在ALT肿瘤细胞中,均有发现较高比例的染色体断裂、融合现象,并发现了双微体,这说明,在ALT肿瘤中,染色体是相当紊乱的。鉴于p53S功能的复杂性,我们又比较分析了相同代数小鼠的DM、TM MEF细胞以及TM肿瘤细胞中的Anaphase brige（后期桥）出现情况,发现在含有p53S的TM细胞中,后期桥的比例明显高于相同代数小鼠的DM细胞,说明p53S会导致染色体的紊乱。综上所述,第一,在MCM pathway中,p53S与MCM2基因的启动区域结合,促进MCM的表达;第二,p53S维持了端粒的长度,这种机制可能是依赖于对MCM的调控;第三,p53S会导致染色体的紊乱。