绵羊EDNRA和EDNRB基因的克隆、组织表达及蛋白结构功能分析

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绵羊内皮素受体家族(Endothelin receptor family,EDNRs)基因主要包括内皮素受体A型基因(Endothelin receptor type A,EDNRA)和内皮素受体B型基因(Endothelin receptor type A,EDNRB),内皮素受体被发现广泛地表达于动物的心血管系统、神经系统和胃肠道之中,与细胞增殖、血管收缩舒张、胃肠道动力和腺体分泌等有密切的关系。目前,有关绵羊的EDNRA和EDNRB基因的全长核酸序列未见报道。本试验以小尾寒羊和杜泊羊为试验材料,采用RT-PCR、RACE、生物信息学分析、荧光定量PCR等技术方法,克隆了绵羊EDNRA和EDNRB基因的全长序列,预测分析了其对应蛋白的结构特征和蛋白特性,检测了其在小尾寒羊和杜泊羊多种组织的表达,从mRNA水平和蛋白水平上探索了绵羊两个基因的表达特性。主要结果如下:  (1) 克隆测序得到了绵羊EDNRA和EDNRB基因的cDNA序列并分析了其序列特征。EDNRA基因全长为4079bp,包含7个外显子,编码427个氨基酸;EDNRB基因全长为4540bp,包含8个外显子,编码441个氨基酸。基因全长已提交至GenBank,并分别获得登录号为KY659244、KY659245。  (2) 蛋白质理化性质分析表明:EDNRA蛋白和EDNRB蛋白均为碱性蛋白、流动性较好、而且都不稳定,两种蛋白的氨基酸构成种类一致,比例相近,预测具有相似的生物学功能;两种蛋白均有明显的跨膜区域,具有多个糖基化位点和磷酸化位点,具有多个蛋白质结合位点和核苷酸结合位点,都具有明显的信号肽,为分泌蛋白;二级结构都以α螺旋为主,都没有卷曲螺旋结构,结构域都为典型的7-tm结构域,两个蛋白质的三级结构模板都为人的EDNRB蛋白。  (3) 多物种氨基酸序列比对分析显示:两种蛋白的氨基酸序列在所选物种中的序列相似性均在80%以上,而EDNRA蛋白在所选物种中的氨基酸序列相似性达到了97.28%,说明两种蛋白在哺乳动物中高度保守,并且,EDNRA蛋白要比EDNRB蛋白更保守和稳定。  (4) EDNRA基因在小尾寒羊和杜泊羊中的卵巢中的表达量最高,在脾脏和胃中的表达量次之,并且,在小尾寒羊卵巢和胃中的表达量显著高于杜泊羊(P<0.05);EDNRB基因在小尾寒羊和杜泊羊中的胃、肾脏和肝脏中表达量均相对较高,并且,该基因在杜泊羊肝脏中的表达量要显著高于小尾寒羊(P<0.05)。两个基因的表达量在卵巢、肾脏中均具有显著性差异(P<0.05);在杜泊羊中肝脏中,EDNRB基因表达量显著高于EDNRA基因(P<0.05)。  (5) 蛋白免疫印迹分析表明,EDNRA蛋白分子大小为63kDa,在肝脏中表达量最高。在EDNRB蛋白的免疫印迹图中,发现了EDNRB蛋白的亚型(EDNRB2),而且,在不同组织中该亚型的表达量要明显高于EDNRB蛋白。我们推测,该蛋白亚型在绵羊生理上具有重要的功能。  综上所述,本试验以小尾寒羊和杜泊羊为实验材料,成功克隆了绵羊EDNRA和EDNRB基因,并对其展开了较为系统的研究。用生物信息学软件详细分析了两个基因及其表达蛋白的特征,并从mRNA水平和蛋白水平探索两个基因的特性及功能,为后续基因功能的研究和绵羊分子育种提供基本的理论依据。
其他文献
本研究参照GenBank收录的绵羊凝乳酶原前体cDNA序列(GenBank No:X53037)设计RT-PCR、PCR与巢式引物,以新生5天的西农萨能羊公羔羊为研究对象,利用手术法采集羔羊皱胃组织,利
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