霉菌毒素（Mycotoxins）是由各种霉菌产生的一系列有毒次级代谢产物。在不同的霉菌毒素中,伏马菌素是世界上玉米种植区最常见的霉菌毒素,由于其与人类和家畜疾病有关,因此玉米谷物中伏马菌素污染被认为是一个严峻的问题。伏马菌素包括伏马菌素B₁、B₂和B₃,是由多种镰刀菌产生的,主要自然产生于串珠镰刀菌、轮枝镰刀菌和多育镰刀菌。伏马菌素可导致马的脑白质软化症,这是在马中发生的一种严重甚至死亡的疾病,也可引起猪的致命疾病-猪的肺水肿综合症。伏马菌素已被国际癌症研究机构（IARC）列为人类可能的致癌物。近年来,霉菌毒素的检测技术不断发展,常见的检测技术有薄层层析法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）及酶联免疫吸附法（ELISA）等。其中高效液相色谱具有较高的灵敏度和可靠性,是当前使用最多的方法。但HPLC需要对样品进行提取净化,操作较为复杂,且检测周期较长。电化学生物传感器将生物分析方法与电化学传感器技术结合,既具有高选择性又兼有高灵敏性,在生物工程、环境监测、医药工业、食品安全和农业分析等领域有广阔的应用前景。纳米材料具有诸多优良特点,如比表面积大、催化活性高、亲和力强、具有优秀的生物相容性等,已广泛应用于电化学生物传感器的制备。近年来,具有微型化、特异性强、灵敏度高的电化学生物传感器技术成为霉菌毒素检测的发展趋势。本试验将饲料中的伏马菌素B₁（FB₁）作为研究对象,通过完全抗原的制备,以单克隆抗体技术为支撑,分别采用间接竞争和直接竞争的检测原理,以硫堇作为信号探针,对构建伏马菌素B,的电化学生物传感器进行了探索。试验Ⅰ基于纳米磁珠和石墨烯信号放大的电化学免疫传感器的构建为了制备FB₁的单克隆抗体并测定其效价,本试验采用戊二醛法将FB₁与卵清蛋白（OVA）载体蛋白偶联,制备FB₁完全抗原FB₁-OVA。偶联后的FB₁-OVA通过考马斯亮蓝试剂盒检测蛋白质含量为1 mg/mL。通过SDS-PAGE鉴定FB₁-OVA偶联成功,将其作为ELISA检测抗体效价的包被抗原。采用腹水制备技术制备腹水型FB₁单克隆抗体。首先,复苏培养杂交瘤细胞,观察细胞形态,测定细胞上清抗体效价及其稳定性。复苏的杂交瘤细胞形态良好,其上清抗体效价为1:1600,分泌抗体稳定性良好。其次,选取20只BALB/c雌性小鼠,腹腔注射杂交瘤细胞悬液。试验期间,每天观察小鼠生长情况,待小鼠腹部膨大时,收集腹水。利用HiTrap Protein G HP蛋白纯化柱纯化腹水获得FB₁的单克隆抗体,通过蛋白质含量测定,FB₁单克隆抗体的浓度为10mg/mL,经SDS-PAGE鉴定,FB₁单克隆抗体分子量为149.50kDa,且抗体纯度较高。通过ELISA测定,FB₁腹水单克隆抗体的效价为1:102400,可用于构建电化学免疫传感器。采用硫堇作为电活性探针,构建了一种新的以Fe₃O₄磁珠作为信号分子载体的电化学免疫传感器用于检测FB₁。首先,利用硫堇与石墨烯制备石墨烯硫堇复合物,通过紫外分光光度计表征石墨烯硫堇复合物合成成功。然后,将连有氨基的Fe304磁珠与羊抗鼠二抗通过戊二醛偶联,获得Fe₃O₄磁珠/Ab2偶联物。用EDC和NHS激活石墨烯硫堇复合物的羧基,与Fe₃O₄磁珠/Ab2偶联物氨基连接,成为该电化学免疫传感器的信号分子。本试验中采用金电极作为工作电极,将金电极浸入半胱氨酸进行自组装,通过戊二醛作为连接臂,修饰FB₁-BSA偶联物,用3%BSA溶液封闭非特异性结合位点。样品溶液中的FB₁与电极表面固定的FB₁-BSA偶联物竞争结合Ab1,信号分子与Ab1连接。通过循环伏安法检测电极表面硫堇的电流响应值对FB₁进行定量。本试验中,通过交流阻抗法对电极修饰过程进行电化学表征,结果显示电极表面进行了层层组装,对电子传递的阻碍逐渐增加。优化了电化学免疫传感器的检测条件,结果发现FB₁-BSA包被抗原的最佳浓度为100μg/mL,Ab1的最佳稀释比例为1:7000,Ab2的最佳稀释比例为1:10000,循环伏安法检测溶液最佳pH为7.0,FB₁与FB₁-BSA竞争结合Ab1的最佳孵育时间为40 min,反应温度为37℃。在最佳试验条件下,该免疫传感器的线性范围从10-8 mg/mL到10-4 mg/mL,线性方程为Ⅰ（μA）=55.7-66.2×1gCFB₁（mg/mL）,相关系数为-0.9989,检测限为0.01 ng/mL。结果表明该传感器具有良好的重复性、重现性、稳定性和特异性。试验Ⅱ基于金纳米颗粒和石墨烯硫堇复合物双重信号放大电化学适配体传感器的构建本试验中,构建了一种基于金纳米颗粒和石墨烯硫堇复合物（GS-TH）双重信号放大的电化学适配体传感器用于检测FB₁。首先,通过改进的氯金酸还原法制备了金纳米颗粒,通过透射电子显微镜表征,制备的金纳米颗粒直径为13 nm。本试验中采用的工作电极为玻碳电极,将金纳米颗粒滴至电极表面干燥后,修饰捕获DNA,捕获DNA与适配体DNA特异性结合,将修饰电极浸入石墨烯硫堇溶液中自组装。通过循环伏安法检测探针硫堇的电化学信号。样品溶液中的FB,与适配体DNA发生特异性结合,使得石墨烯硫堇复合物从电极表面脱落,电化学信号降低。通过循环伏安法检测电极表面硫堇的减少量对FB₁进行定量。优化了电化学适配体传感器的检测条件,捕获DNA的最佳反应浓度为0.25μM,石墨烯硫堇复合物固定的最佳时间为3 h。在优化条件下,建立该电化学适配体传感器用于检测FB,的标准曲线,其中FB₁浓度的线性范围为10-12至10-4 mg/mL,线性方程为△I（μA）=1.175+0.067×1gCFB₁（mg/mL）,相关系数为0.9982,FB₁的检测限为1 pg/mL。结果表明该传感器具有良好的重复性、重现性、稳定性和特异性。试验Ⅲ电化学适配体传感器与高效液相色谱法的比较在试验Ⅱ中已建立的电化学适配体传感器标准曲线,通过样品的加标检测,FB₁的最低检测限为1μg/kg。测定玉米、小麦和全价饲料样品中FB₁的回收率,添加FB₁浓度分别为5μg/kg、50μg/kg和100μg/kg,结果显示,三种饲料的回收率均高于90.0%,变异系数均小于10.0%。本试验建立FB₁高效液相色谱法的标准曲线,FB₁的检测范围为10～1000 ng/mL,线性相关系数r为0.9998。通过样品的加标检测,FB₁的最低检测限为10μg/kg。测定玉米、小麦和全价饲料样品中FB₁的回收率,添加FB₁浓度分别为50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg,三种饲料的回收率均高于80.0%,变异系数均小于10.0%。收集来自全国各地饲料送检样品62份,主要包括玉米、小麦、全价饲料等其他饲料。经过提取、净化后,分别采用电化学适配体传感器和HPLC检测样品中FB₁的含量。结果显示,62份饲料样品,两种检测方法的检出率均为100%。采用电化学适配体传感器检测全部饲料样品中FB₁平均含量为833.3μg/kg,高于HPLC检测值791.4μg/kg。比较适配体传感器和HPLC两种检测方法的相关性,将检出FB₁饲料的HPLC检测结果作为横坐标,同一样品的适配体传感器结果作为纵坐标,建立相关曲线,相关系数为0.9999,结果表明,适配体传感器和HPLC方法对于检测饲料中FB₁具有良好的相关性。以上结果说明电化学适配体传感器在线性范围内可用于农产品中FB₁的检测,与HPLC相比具有更高的灵敏度。