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研究背景肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,在肿瘤相关死亡数中高居第二位。而肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）占原发性肝脏肿瘤的80%。目前认为HCC的发病涉及肝细胞本身和肝脏微环境因素,但确切机制还不清楚。对于早期HCC病人,肿瘤切除或肝脏移植是根治性治疗方法。然而许多病人就诊时已处于中晚期,无法从手术中获益。对于中晚期的HCC患者,现阶段唯一有效的治疗药物是索拉非尼。但是索拉非尼只能延长患者平均两到三个月的生存期。因此,为了找到更加有效的HCC治疗策略,阐明HCC发生发展的分子机制显得尤为重要。β-catenin（由CTNNB1编码）是Wnt信号通路的关键组成部分。HCC病人标本大规模全基因组筛查发现β-catenin、c-Met和端粒酶是最常见的突变。20%-40%的病人存在CTNNB1基因突变。在HCC鼠模型中,大约25%存在CTNNB1突变及表达升高。与此一致的是,多项研究显示β-catenin能够协同其他信号通路促进肝癌发生。然而,亦有研究报道肝细胞特异性β-catenin敲除鼠对DEN诱导的肿瘤形成更加敏感,机制包括过度的氧化应激、肝损伤和炎症。另有研究提示活化的Wnt/β-catenin信号通路能够通过抑制Hippo信号通路中YAP/TAZ和Notch信号通路之间的正反馈,进而抑制HCC形成。因此,β-catenin在HCC中的确切作用仍需进一步探索。最近有研究报道一种新的构建HCC鼠模型的方法,称作水动力转染（hydrodynamic transfection,HT）技术。在人HCC标本中,c-Met和β-catenin基因同时激活十分常见。而使用HT技术结合睡美人转座子（Sleeping Beauty transposon,SB）系统,共转染c-Met（MET）和持续激活型β-catenin（ΔN90-β-catenin,CAT）进入鼠肝脏时,能够快速有效的引起原发性肝癌。因此,这一方法使得我们能够结合传统转基因鼠模型,研究不同基因在肝癌发生中的相互作用。研究目的为了确定β-catenin肝细胞特异性缺失造成的微环境对HCC发生的影响,本课题拟结合水动力转染技术和肝细胞敲除β-catenin转基因鼠模型,采用共转染MET和CAT质粒的方式建立小鼠肝癌模型,通过分子生物学和生物信息学等方法,探讨肝脏条件性敲除β-catenin在MET/CAT诱导的鼠HCC中的作用及可能机制,探索肝癌发生的促进因素,以期为HCC的发病机制与临床防治提供实验依据及治疗靶点。研究方法1、动物模型的建立。（1）建立肝细胞条件性敲除β-catenin转基因小鼠模型。取C57BL/6品系的β-cateninflox/flox小鼠与Albumin-Cre+小鼠杂交,后代经基因检测挑选出β-cateninflox/+;Alb-Cre+鼠,再将该基因型鼠与β-cateninflox/flox鼠杂交,后代经基因检测挑选出β-cateninflox/flox;Alb-Cre+即肝细胞特异性敲除β-catenin(β-cateninΔhep)小鼠。（2）建立癌基因MET/CAT诱导的HCC小鼠模型。选取雄性C57BL/6的野生型（WT）小鼠和上一步建立的β-cateninΔhep鼠,分为两组:第一组含WT鼠、β-cateninΔhep鼠各8-12只,8周龄时处死,留取肝脏、脾脏、血液和鼠尾等组织标本。第二组含WT鼠、β-cateninΔhep鼠各16-18只,在8周龄时采用HT技术经鼠尾静脉注射含有MET、CAT和SB转座酶质粒的生理盐水,三者比例为10:10:0.8,溶液浓度为10.4μg/ml生理盐水,每只鼠的注射剂量（ml）为体重（g）的10%,注射全过程在7秒内完成。在注射质粒后第3天、第7周分别处死WT鼠、β-cateninΔhep鼠各8-9只,留取肝脏、脾脏、血液和鼠尾等组织标本。利用鼠尾、肝脏组织分别行基因检测和Western blot,验证基因表型。2、观察肝细胞条件性敲除β-catenin对小鼠肝脏及HCC发生的影响。（1）观察条件性敲除β-catenin对肝脏的影响。分别测量8周龄WT鼠、β-cateninΔhep鼠肝脏重量、体重,计算肝脏/体重比。H&E染色观察两组肝脏形态学差异。免疫荧光法染色Ki67检测肝细胞增殖情况。TUNEL法检测肝细胞凋亡情况。（2）观察条件性敲除β-catenin对HCC发生的影响。注射质粒后7周处死组小鼠,留取肝脏组织,统计肿瘤数目、肝脏/体重比、肿瘤最大直径;H&E染色分析肿瘤病理类型。注射质粒后3天、7周处死组小鼠的肝组织冰冻切片行Ki67免疫荧光染色,检测肝细胞增殖情况。TUNEL法检测肝细胞凋亡情况。Western blot观察条件性敲除β-catenin对细胞粘附作用的影响。3、检测肝细胞条件性敲除β-catenin对HCC基因表达谱的改变。对于不同时间点的肝脏标本行RNA sequencing（RNA-seq）检测,比较WT鼠与β-cateninΔhep鼠基因表达谱的差异,使用生物信息学方法,筛选差异基因并进行初步验证。4、检测肝细胞条件性敲除β-catenin对HCC信号通路的改变。注射质粒后3天处死组小鼠的肝脏冰冻切片,行免疫荧光染色,检测表达c-Met及β-catenin的细胞数量,比较WT鼠与KO鼠质粒转染效率。3个不同时间点的肝组织行Western blot,检测c-Met及β-catenin表达水平;检测Wnt/β-catenin、MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路蛋白表达水平。Real-time PCR法、Western blot、免疫组化法检测转录因子Sox9表达水平。5、检测肝细胞条件性敲除β-catenin对HCC局部炎症的影响。对于不同时间点的模型,免疫组化法检测F4/80、Ly6G和B220,免疫荧光法检测CD3,观察局部炎症细胞的分布。Real-time PCR法检测IL-12、TGF-β1、TNF-α、IL-1β和IL-6,观察局部细胞和炎症因子的表达。H&E染色观察肝脏形态学差异。研究结果1、肝细胞条件性敲除β-catenin减缓了小鼠肝脏发育,肝脏重量、肝脏/体重比降低。但肝脏H&E染色、Ki67、TUNEL染色无显著性差异。2、肝细胞条件性敲除β-catenin明显加剧了小鼠肝癌发生。注射质粒7周后KO鼠与WT鼠相比,肿瘤数目、肝脏/体重比、肿瘤最大直径明显增加。H&E染色提示为HCC。Ki67免疫荧光染色提示肝细胞增殖明显加快。TUNEL检测提示细胞凋亡在肿瘤区域显著增加。Western blot结果显示条件性敲除β-catenin引起γ-catenin表达升高,E-cadherin降低,N-cadherin无明显变化,提示没有影响细胞粘附作用。3、RNA-seq结果显示肝细胞条件性敲除β-catenin引起基因表达谱改变,肿瘤相关正性调节基因及信号通路表达增加。8周龄KO鼠与WT鼠相比,细胞外基质和免疫反应相关通路表达升高。注射质粒3天后KO鼠E2F1下游基因和细胞周期下游基因表达减少。注射质粒7周后KO鼠炎症相关基因、缺氧相关信号通路、HIF1α转录网络、c-Jun下游基因、DNA损伤正性调控基因和淋巴细胞凋亡负性调控基因表达明显增加。KO鼠中Sox9、IL-6、IL-6通过Stat3调节的相关基因表达始终高于WT鼠。4、肝细胞条件性敲除β-catenin激活了多种HCC信号通路。Western blot结果显示KO鼠与WT鼠相比,Wnt/β-catenin、MAPK/ERK和PI3K/Akt通路多种信号分子表达升高,下游转录因子Cyclin D1和Sox9增加。5、肝细胞条件性敲除β-catenin明显加重了肝脏局部炎症。免疫组化和免疫荧光检测提示,注射质粒3天后KO鼠与WT鼠相比,F4/80和CD3表达增加。注射质粒7周后KO鼠Ly6G和B220表达增加。Real-time PCR结果显示,8周龄KO鼠TGF-β1和IL-6升高;注射质粒3天后KO鼠IL-12、TGF-β1、TNF-α、IL-1β和IL-6表达均显著增加;注射质粒7周后KO鼠IL-12、IL-1β和IL-6显著升高。结论肝细胞条件性敲除β-catenin促进了水动力转染MET/CAT质粒引起的鼠HCC。可能机制包括:局部炎症加剧,Wnt/β-catenin、MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路过度激活,转录因子Cyclin D1和Sox9表达增加,肿瘤相关正性调节基因及信号通路表达增加等。这些机制提示肝细胞β-catenin缺失改变了肝脏微环境,促进了HCC发生。