南方红豆杉聚戊烯醇的分离纯化与抗肝纤维化作用研究

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中药材资源的综合利用对中药行业的可持续发展起着举足轻重的作用。以有限的资源创造最大的价值,是保护中药材资源的重要内容。南方红豆杉(Taxus Chinensis var. mairei)是提取紫杉醇及其前体物质的重要原料,由于针叶内此类物质含量低导致在生产过程中产生大量的废弃物。而南方红豆杉针叶中及生产紫衫醇类化合物产生的废弃物中富含聚戊烯醇类化合物,这为红豆杉针叶资源的综合利用开辟了新的途径。本文对南方红豆杉针叶中的聚戊烯醇化合物进行了提取分离、检测、组分分析、含量变化、纯化制备、结构鉴定、以及抗肝纤维化活性等一系列研究,旨在为南方红豆杉针叶资源的综合利用和可持续发展提供理论依据,同时为其他中药材资源的合理利用提供借鉴。主要研究结果如下:(1)采用索氏提取方法提取南方红豆杉针叶中的聚戊烯醇类化合物,建立了聚戊烯醇的高效液相色谱和液质联用等分析方法。HPLC具体分析参数为:XBridge RP C18(5μm,4.6mm×250mm);柱温40℃;流速:1.5mL/min;进样量:10μL;紫外检测波长:210nm。流动相:甲醇(A)和异丙醇(B),梯度洗脱:0-5min,40%B;5-35min,40%→75%B;36min,40%B;50min,40%B。结果表明,南方红豆杉聚戊烯醇(Taxus polyprenols, TPs)共有11个同系物,并呈双家族分布特征。(2)利用上述方法分析了不同月份南方红豆杉当年生针叶中TPs的含量结果表明,不同年龄植株针叶中TPs的含量变化趋势基本一致,即自生长初期开始积累至10~11月份达到最高(42.43mg/g),当气温降低含量下降,待次年4月份又有回升趋势,说明植株内TPs可能与温度存在一定的相关关系。不同年龄植株同一时间的TPs含量也有所差异,这可能是微环境不同所致。此外,初步研究表明光照强度对叶片内TPs含量有一定影响,高光强有利于聚戊烯醇类物质的积累。(3)对南方红豆杉聚戊烯醇的规模化分离纯化制备工艺进行了系列研究,以期为南方红豆杉聚戊烯醇的广泛应用提供技术基础。以索氏提取法制备TPs粗提物浸膏,通过丙酮冷析、水解、硅胶柱色谱等除杂方法对TPs的纯化工艺进行了探索,工艺如下:粗提物制备参数:800g南方红豆杉针叶原料,80℃索氏提取12h。水解参数:样品,石油醚提取物100g;转速,240rpm/min;水解液,5%NaOH甲醇溶液(含0.05%焦没食子酸);水解温度60℃;水解时间:8h。丙酮冷析参数:4~5℃,4h或室温下24h。硅胶柱层析参数:上样量1:30,洗脱液石油醚和乙酸乙酯(19:1,v/v),洗脱流速30mL/min。根据以上参数制备聚戊烯醇得率约为0.6%。按照以上流程及工艺参数制备TPs(>85%, HPLC测定)用作抗肝纤维化活性研究。此外,探索了HSCCC分离纯化TPs的前期工艺条件,为聚戊烯醇分离纯化提供新的方法。(4)在硅胶柱色谱分离纯化的基础上,进一步采用制备型]HPLC分离纯化聚戊烯醇单体,并借助UV、IR、1HNMR和13C NMR等常规波谱手段对其进行了结构鉴定,结合液质联用分析结果表明TPs包含的同系物分别为polyprenol-14~polyprenol-24,结构类型为桦木醇型聚戊烯醇。(5)动物实验表明TPs具有一定的抗肝纤维化作用,能够缓解由CCl4诱导SD大鼠的肝纤维化进程。结果表明,TPs能够显著提高机体抗氧化能力、抑制肝星状细胞活化、下调促肝纤维化细胞因子和保护肝细胞等,其抗纤维化作用可能通过抑制TGFβ/Samd2/3信号通路来实现。此外,细胞实验表明TPs的保肝作用可能与体内代谢物多萜醇有关,有待进一步研究。
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