背景及目的胃肠肿瘤是消化系统最常见的恶性肿瘤,严重危害着人类的生命与健康。近20多年来,随着人们生活水平的提高、高脂高糖饮食的增加及环境不断的恶化,我国胃肠肿瘤的发病率和病死率均呈明显上升的趋势。大肠癌根据解剖结构可分为结肠癌和直肠癌。大肠癌在全球范围内是最常见肿瘤之一,据报道,2008年,全球新发的病例共有120万,并有60.9万人因大肠癌而死亡,约9%的癌症相关死亡由大肠癌所致。世界各个地区的大肠癌发病率之间差异很大,最高者见于北美洲和大洋洲,其次为欧洲、亚非地区较低。在我国,南方尤其是东南部沿海地带的发病率明显高于北方。我国的大肠癌的发病率近年来呈明显的上升趋势,据研究,2010年我国的大肠癌发病率居常见恶性肿瘤的第四位,仅次于肺癌、胃癌、肝癌。在某些发达地区大肠癌发病率已居恶性肿瘤发病率的第2位。目前多项研究发现,在大肠癌的发生发展过程中,有着多种基因的共同参与。Vogelstein于1988年第一次提出大肠癌发生发展模式的概念,即多基因、多阶段、多步骤的模式,进而越来越多的参与大肠癌发生发展过程的基因被发现。胃癌(gastric carcinoma, GC)是世界最为常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率分别位居各种恶性肿瘤的第二位和第三位。在我国,胃癌的发病率和死亡率均居消化系统恶性肿瘤的首位,五年总生存率低于30%。全球每年新发的胃癌患者可达100万余,我国占到42%,死亡的胃癌患者约为80万,我国占到35%,为胃癌发病率和死亡率最高的国家之一。早期胃癌患者并没有特异性的临床症状及体征,因此临床上就诊的胃癌患者大多数已发展为晚期胃癌,甚至出现远处转移,通常已经错过最佳的手术时机。胃癌患者预后的影响因素很多,其中最重要的两个原因为侵袭和转移。肿瘤导致患者死亡的主要原因之一,是在肿瘤发生发展过程中出现的远处转移及其引发的相关并发症。深入研究胃肠道肿瘤的浸润及转移机制,将有助于开发针对浸润及转移的分子及基因靶向治疗,具有重要的临床意义。锌指蛋白在真核生物中表达广泛,广泛参与细胞的分化、增殖和凋亡等多种重要生命过程。近几年来,有关锌指蛋白在肿瘤发生发展中的作用引起了各个领域的学者们的广泛关注,研究证实许多锌指蛋白家族通过对基因转录、表达的调控从而介导肿瘤的发生与进展。锌指蛋白703(zinc finger protein703,ZNF703)属于NET/NLZ锌指家族转录因子成员之一,是最近发现的乳腺癌致癌基因,调节许多基因的表达,参与调控肿瘤细胞的增殖、分化和浸润。目前研究已显示ZNF703在人类乳腺癌、子宫内膜癌中高表达,并且其过表达与肿瘤的发生、浸润和转移方面有关。然而,ZNF703是否在胃肠道肿瘤中有表达,是否参了胃肠肿瘤的发生发展及其具体的生物学行为,尚未见研究报道。幽门螺杆菌感染与胃癌的发生密切相关,自1983年澳大利亚科学家Barry J.Marshall(巴里·马歇尔)和J.Robin Warren(罗宾·沃伦)首次成功地从人的胃粘膜上皮中分离培养出幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori, Hp)以来,Hp已逐渐成为国内外许多专家、学者们研究的热点,1994年世界卫生组织((world health organization, WHO)已将幽门螺杆菌列为人类胃癌的第1类致癌因子。Hp可导致胃癌的发生,其是否与癌基因ZNF703有联系,尚未见研究报道。因此,在本课题研究中,我们检测肠癌细胞及肠癌组织中ZNF703的表达情况,分析ZNF703与大肠癌的临床病理特征之间的关系；利用RNA干扰大肠癌细胞株LoVo细胞中ZNF703的表达,初步探讨ZNF703基因沉默对肠癌细胞株LoVo细胞的生物学行为的影响。我们也检测胃癌细胞及胃癌组织中ZNF703的表达情况,在体外用幽门螺杆菌与正常胃粘膜细胞共孵育,试图了解幽门螺旋杆菌与ZNF703有无关系。方法(1) ZNF703mRNA和ZNF703蛋白在大肠癌组织中的表达收集30组新鲜的大肠癌组织与癌旁正常大肠黏膜组织标本,采取RT-PCR技术在mRNA水平检测ZNF703基因在22组大肠癌组织与癌旁正常大肠黏膜组织中的表达情况；同时用Western blot技术在蛋白水平检测ZNF703蛋白在26组大肠癌及癌旁组织中的表达情况。(2)ZNF703表达与大肠癌患者临床病理特征的关系。采用免疫组织化学方法检测ZNF703在112个大肠癌组织石蜡标本、58个癌旁正常肠粘膜组织石蜡标本和23个转移性淋巴结石蜡标本中的表达情况,并分析ZNF703蛋白表达与大肠癌患者临床病理学参数(包括年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、分化程度、侵润程度、淋巴结转移和AJCC分期)之间的关系。分析ZNF703蛋白表达与大肠癌预后的关系。(3)采用Western blot技术检测8种大肠癌细胞株中ZNF703的表达及定位。选择ZNF703高表达的大肠癌LoVo细胞株,设计并合成特异性针对ZNF703的小干扰RNA序列(ZNF703-siRNA)转染细胞。Western blot检测siRNA对ZNF703表达的影响,并进行体外细胞功能实验,研究ZNF703基因沉默对于LoVo细胞株增殖、迁移等生物学行为的影响。(4)采用RT-PCR、western blot及免疫组化方法检测ZNF703在胃癌组织及癌旁组织中的表达。采用RT-PCR、western blot方法检测正常胃粘膜细胞株及胃癌细胞株中ZNF703的表达。(5)采用CagA阴性及CagA阳性幽门螺旋杆与正常胃粘膜细胞株共孵育,western blot检测ZNF703表达情况。数据分析采用spss16.0统计学软件进行统计学处理,统计学方法采用χ2检验和spearrman等级相关分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果(1) RT-PCR发现,ZNF703mRNA在肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织。western blot发现,ZNF703在大肠癌组织中呈高表达,阳性表达率为65.38%(17/26),癌旁正常肠黏膜组织中低表达或无表达,阳性率为34.62%(9/26),差异具有统计学意义(p<0.05)。免疫组化发现,ZNF703主要在胞核内表达(78/112,69.64%),部分可在胞浆或细胞膜表达。ZNF703在大肠癌组织中的阳性表达率为77.68%(87/112),而在癌旁正常粘膜组织中的阳性表达率为9.4%(3/32),差异具有统计学意义(p<0.05)。ZNF703蛋白在23例转移性淋巴结组织中阳性表达率为91.3%(22/23)。(2)免疫组化结果结合临床病理资料发现,ZNF703的表达水平与大肠癌患者的年龄(p=0.524)、性别(p=0.152)、肿瘤的大小(p=0.063)、部位(p=0.108)、分化程度(p=0.742)以及AJCC分期(p=0.406)无明显相关性,差异均不具有统计学意义(P>0.05)。ZNF703阳性表达与肿瘤浸润肠壁的深度(P=0.028)以及是否有淋巴结转移(P=0.006)密切相关。ZNF703在突破浆膜层和未突破浆膜层的大肠癌组织中阳性表达率分别是52.9%(36/68)和31.8%(14/6),差异具有统计学意义(P<0.05)。ZNF703在有淋巴结转移和无淋巴结转移的大肠癌组织中阳性表达率分别是55.2%(32/58)和29.6%(16/54),差异具有统计学意义(P<0.01)。生存分析发现,ZNF703高表达是大肠癌患者不良预后因素。(3)western blot发现,ZNF703在人大肠癌细胞株(LS174T, SW480, HT29, SW620, DLD1, SW1116, LoVo, Caco-2细胞)均有表达,其中,ZNF703在LoVo细胞中表达最高,在CaCo细胞中表达最低。提取LoVo细胞膜、细胞质和细胞核蛋白行western blot检测发现,ZNF703在LoVo细胞的胞膜、胞质和胞核中均有表达。(4) western blot检测发现,ZNF703-siRNA能有效的下调ZNF703的表达；MTT显示,LoVo细胞在转染siRNA-ZNF70348小时后开始出现增殖的抑制,随着转染时间的延长,细胞生长的抑制率越来越高,与阴性干扰组和空白对照组具有统计学意义(P<0.01)；划痕实验显示,LoVo细胞在划痕后24h和48h,si-ZNF703处理组划痕愈合速度显著慢于阴性干扰组和空白对照组(P<0.01)。Transwell迁移实验结果显示,LoVo细胞在转染siRNA-ZNF703后迁移能力显著减弱,siRNA-ZNF703组到达下室的细胞数与阴性对照组和空白对照组相比均有显著性差异(P<0.01)。(5)免疫组化染色显示,ZNF703在胃癌组织中高表达(阳性率为85%,51/60),在正常胃粘膜组织中不表达或低表达(阳性率为12%,3/25),两组间具有统计学差异(P=0.021)。western blot显示,ZNF703在胃癌组织中均有表达,但在正常胃粘膜组织中低表达。RT-PCR检测发现,胃癌组织中有ZNF703mRNA的表达,但在正常胃粘膜组织中ZNF703mRNA表达量低或不表达。(6)western blot显示,ZNF703在胃癌细胞株(AGS, SGC7901, MGC823, BGC802)中均有表达,但在正常胃粘膜细胞株(GES-1)中不表达。RT-PCR检测发现,胃癌细胞株均有ZNF703mRNA的表达,但在正常胃癌细胞株中ZNF703mRNA低表达或无表达(P=0.029)。(7)western blot实验结果发现,幽门螺旋杆菌标准株NCTC11637(CagA+)可上调正常胃粘膜细胞株(GES-1)ZNF703蛋白的表达,但幽门螺旋杆菌突变株SS1对GES-1细胞中ZNF703蛋白的表达无影响(P=0.037)。结论(1)ZNF703在大肠癌中高表达,与大肠癌侵犯浆膜以及淋巴结转移密切相关：肠壁浸润的深度越深,且伴有淋巴结转移的肿瘤组织中,ZNF703表达越高。肠癌组织中ZNF703高表达亦与大肠癌的预后密切相关。(2)ZNF703基因沉默可抑制大肠癌增殖及迁移,提示ZNF703过表达与大肠癌的进展密切相关,ZNF703是促进大肠癌侵袭和转移的重要基因,有可能成为大肠癌转移治疗的一个潜在靶标。(3)ZNF703在胃癌中高表达；Hp野生株可上调正常胃粘膜细胞ZNF703的表达,提示ZNF703可能参与幽门螺旋杆菌致癌的致病机理。