[研究背景]角蛋白是一类典型的上皮细胞中间丝蛋白,具有分子多样性的特点。在人类,存在54种功能角蛋白基因。在不同的上皮类型或者不同的细胞分化状态中,角蛋白的表达形式存在特异性。作为上皮细胞骨架的组成部分,角蛋白在维持上皮细胞机械稳定性和组织完整性中参与重要作用。除了结构性功能外,近年来,一些角蛋白还被发现具有新的调节功能,如参与细胞凋亡、炎症反应、创伤应答和组织重塑。角质形成细胞是皮肤表皮的主要构成细胞,皮肤通过调节角质形成细胞增殖和分化来维持其屏障功能。在角质形成细胞分化之初,角质形成细胞主要表达早期分化标记物,如:角蛋白1和角蛋白10。随着分化的不断进展,角质形成细胞开始表达不同的分化相关蛋白,如:fillaggrin,involucrin,loricrin,角蛋白2等。既往研究发现,角蛋白异常与包括增殖性皮肤病和遗传性皮肤病在内的多种皮肤疾病相关。在银屑病中,角质形成细胞的增殖与分化存在异常,角质形成细胞表现为高增殖和异常分化的状态,而这些是银屑病皮损形成的主要原因。皮肤创伤修复是一种复杂的生理过程,由多种类型的细胞和信号通路的参与。其中,真皮成纤维细胞已被广泛用于皮肤创伤修复机制的研究中。既往研究已经阐明,真皮成纤维细胞的迁移、增殖以及其分泌细胞外基质的功能在皮肤创伤修复中发挥重要作用。基于成纤维细胞的细胞疗法可以作为皮肤过度炎症和组织修复延迟的一种治疗方法。与此同时,既往研究亦表明,角蛋白在对皮肤创伤愈合和组织修复过程中发挥重要作用。角蛋白敷料可防止伤口干燥,促进皮肤屏障建立,从而促进伤口愈合。角蛋白24(Keratin 24,K24)是一种新型角蛋白,它是一种包含有525个氨基酸的角蛋白样蛋白,属于Ⅰ型角蛋白聚合物。K24在角质形成细胞、胎盘、结肠、脾脏中表达较丰富。在人类,有研究发现,K24可能是早期大肠癌的发病的易感基因。亦有研究表明,K24参与角膜上皮细胞的终末分化。然而其在皮肤细胞中的生物学功能尚未阐明。[目的]本研究目的在于,一方面通过研究K24在表皮角质形成细胞中的表达及生物学作用,为探索K24与银屑病之间的关联奠定基础;另一方面,通过研究K24在真皮成纤维细胞中的作用及功能,以期发现其在皮肤创伤修复中的潜在应用价值。[方法]第一部分:分离培养正常人及银屑病患者皮损区表皮角质形成细胞,提取细胞总RNA和蛋白质。通过qRT-PCR和Western blot法检测正常人以及银屑病患者皮损区表皮角质形成细胞中K24的mRNA及蛋白表达水平;利用细胞和组织免疫荧光法检测正常角质形成细胞和人体皮肤组织中K24的表达和定位;通过体外传代和CaC12诱导分化两种方法,观察不同分化状态的角质形成细胞中K24的表达差异。利用慢病毒转染技术,建立过表达K24的角质形成细胞模型。通过qRT-PCR和Western blot法验证慢病毒转染后K24在角质形成细胞中过表达的效率。利用Western blot法分析K24过表达后其下游蛋白分子,如细胞分化、细胞周期、上皮间充质转化、PKC信号通路相关蛋白表达水平;通过细胞功能学实验方法观察K24过表达对角质形成细胞增殖、细胞周期、分化、衰老、凋亡以及迁移的影响。构建Krt24-GFP转基因小鼠,获得稳定阳性子代后,分离培养其表皮角质形成细胞,通过qRT-PCR法,与野生型小鼠表皮角质形成细胞对比分析,验证前述实验结果。第二部分:利用慢病毒转染技术,构建过表达K24的真皮成纤维细胞模型,并通过qRT-PCR和Western blot法确认慢病毒的感染效率。继而主要通过qRT-PCR、Western blot法及细胞功能学实验方法研究K24过表达后对真皮成纤维细胞增殖、迁移、衰老的影响。分离培养Krt24-GFP转基因小鼠真皮成纤维细胞,通过细胞功能学检测以及qRT-PCR法,与野生型小鼠真皮成纤维细胞进行对比分析,验证前述实验结果。[结果]一、K24在表皮角质形成细胞中的表达及作用1.Western blot结果提示,体外培养的银屑病皮损区来源的角质形成细胞中K24的蛋白表达水平低于正常角质形成细胞。2.细胞免疫荧光检测发现,K24在正常人角质形成细胞中呈胞浆分布;组织免疫荧光检测发现,在正常人表皮中,K24主要表达于棘细胞上层,在基底层及棘层少量表达。3.通过体外传代和Ca2+诱导两种方法诱导人角质形成细胞分化发现,与对照组相比,K24在衰老及分化较为明显的角质形成细胞中蛋白表达更丰富。4.MTS及EdU检测提示,与对照组相比,正常人角质形成细胞过表达K24后,增殖能力及细胞活性降低;流式细胞周期结果显示,K24过表达的人角质形成细胞出现了细胞周期的G1/S期阻滞;Western blot结果进一步提示,增殖相关蛋白K14、K17、c-Myc表达下调;细胞周期相关蛋白p53,p21表达上调。5.透射电镜法及流式凋亡检测提示,K24过表达诱导自噬并促进人表皮角质形成细胞凋亡的发生;Western blot结果提示,自噬相关蛋白Atg5和Atg7,凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3表达上调。6.Western blot结果提示,K24过表达促进人表皮角质形成细胞的分化,角质形成细胞分化相关蛋白Kl,loricrin和involucrin的表达上调。7.细胞免疫荧光结果提示,K24过表达诱导人表皮角质形成细胞的细胞形态发生改变,细胞骨架蛋白α-tubulin表达上调;β半乳糖苷酶检测提示,K24过表达亦促进角质形成细胞衰老的发生。8.Transwell试验结果提示,K24过表达抑制人表皮角质形成细胞的迁移能力;Western blot结果提示,K24过表达促进角质形成细胞EMT相关蛋白E-cadherin表达上调,N-cadherin和Slug表达下调。9.Western blot结果提示,人表皮角质形成细胞过表达K24后,与对照组相比,PKCS蛋白磷酸化水平增加。10.qRT-PCR结果提示,与野生型小鼠来源的表皮角质形成细胞相比,Krt24过表达小鼠来源的表皮角质形成细胞在过表达Krt24mRNA的基础上,低表达Krt14,高表达loricrin及involucrin,高表达p21及p53,提示Krt24转基因小鼠表皮角质形成细胞增殖能力减弱,呈趋于分化及衰老的状态。二、K24对真皮成纤维细胞的作用及功能影响1.K24过表达通过促进人真皮成纤维细胞的细胞周期由G1期向S+G2/M期过渡,从而增强了成纤维细胞的增殖及克隆形成能力。2.K24过表达促进人真皮成纤维细胞的迁移能力,上调间质表型标记蛋白:α-SMA、FN、β-catenin、MMP3及细胞外基质产物Collagenla在蛋白水平的表达。3.K24过表达抑制人真皮成纤维细胞的衰老,同时抑制了细胞周期及衰老相关蛋白p53、HMGN2、HMGB2在mRNA及蛋白水平的表达。4.MTS检测提示,Krt24转基因小鼠来源的真皮成纤维细胞较野生型小鼠来源的真皮成纤维细胞增殖能力增强。5.Transwell结果提示,Krt24转基因小鼠来源的真皮成纤维细胞较野生型小鼠来源的真皮成纤维细胞迁移能力增强;qRT-PCR结果提示,在mRNA水平,与野生型小鼠成纤维细胞相比,Krt24转基因小鼠成纤维细胞中E-cadherin表达下调,而 FN、N-cadherin、α-SMA、Vimentin、PAI-1 和 MMP3 表达上调,进一步提示Krt24转基因小鼠来源的真皮成纤维细胞迁移能力增强。6.qRT-PCR结果提示,在mRNA水平,与野生型小鼠真皮成纤维细胞相比,Krt24转基因小鼠真皮成纤维细胞中Collagenla和Collaggen3a表达上调,提示Krt24转基因小鼠真皮成纤维细胞胶原合成能力增强。[结论]K24在正常角质形成细胞中蛋白水平高于银屑病角质形成细胞。在正常人表皮角质形成细胞中,K24主要呈胞浆分布;在正常人表皮中,K24主要表达于棘细胞上层。K24过表达于表皮角质形成细胞后,抑制角质形成细胞增殖、迁移,促进细胞分化、衰老、自噬及凋亡的发生。K24过表达可促进真皮成纤维细胞的增殖和迁移能力,抑制衰老发生,即与其在表皮角质形成细胞中发挥的相应生物学作用(增殖、迁移、衰老)相反,此外,K24过表达的真皮成纤维细胞表现为细胞外基质合成能力增强。