羊毛是养羊业的主要产品之一,也是毛纺工业的重要原料,羊毛品质和产量直接影响羊毛在市场经济中的竞争力。毛囊是调控羊毛生长的主要的器官,其中的毛乳头、毛母质和内根鞘中基因的表达及互作对毛囊的增殖与分化有重要调控作用,而对毛囊增殖与分化的分子调控机制的研究将有助于利用分子育种技术改良羊毛品质。因此本研究首先以结构较完整、纯度较高的人毛囊的毛乳头细胞、毛母质细胞和内根鞘细胞作为材料,利用基因芯片筛选细胞间的差异表达基因,并在体内进行初步验证鉴定影响毛囊增殖和分化的候选基因及调控通路。其次利用转基因技术验证绵羊毛囊组织特异型启动子的活性,为利用转基因技术改良绵羊羊毛品质提供可诱导外源基因在羊毛毛干中表达的调控元件。具体结果如下:1.细胞间差异表达基因的筛选和分析(1)毛乳头细胞、毛母质细胞和内根鞘细胞间差异表达基因的筛选。①依据毛乳头细胞、毛母质细胞和内根鞘细胞在毛囊中的位置以及在毛囊生长发育过程中所发挥的作用,分别分析毛乳头细胞和毛母质细胞、毛母质细胞和内根鞘细胞之间的差异表达基因(P<0.01,Fold chage≥2)。毛乳头细胞和毛母质细胞之间差异表达的基因1004个,其中369个在毛乳头细胞中上调表达。毛母质细胞和内根鞘细胞之间差异表达的基因1218个,其中774个在毛母质细胞中上调表达。②为了筛选出细胞中特异上调表达的基因,我们将一种细胞同时与另外两种细胞比较(芯片检测信号>26,P<0.01,Fold chage≥2),得出毛乳头细胞特异上调表达的基因58个,毛母质细胞特异上调表达的基因337个,毛囊内根鞘细胞特异上调表达的基因85个。(2)毛乳头细胞、毛母质细胞和内根鞘细胞特异上调表达基因的GO分析。分析结果显示,毛乳头细胞中特异上调表达基因的功能主要与细胞对外界刺激的应答、细胞生长相关,例如:“regulation of response to external stimulus”、“regulation of inflammatory response”、“negative regulation of multicellular organismal process”、“regulation of growth”。毛母质细胞中特异上调表达基因的功能主要与转录调控、细胞增殖、细胞凋亡及细胞粘附相关,例如:“regulation of transcription”、“regulation of cell proliferation”、“regulation of programmed cell death”、“cell adhesion”。内根鞘细胞中特异上调表达基因的功能主要与信号转导、粘附相关,例如:“cell surface receptor linked signal transduction”、“cell adhesion”、“Wnt receptor signaling pathway”、“cell-matrix adhesion”。从毛乳头细胞特异上调表达的基因中选择ADH1B、CNR1、STMN2、WIPS2、CIDEC,毛母质细胞特异上调表达的基因MMP1、MMP3、TXNDC5、DNER、DPP4、SERPINB2、FGF2、EGR1,內根鞘细胞特异上调表达的基因SOX2、IFITM1、CRISPLD2、WNT5A、COL5A1、ECM2进行实时荧光定量PCR检测,检测结果与细胞芯片结果相符合。(3)差异表达基因编码的蛋白在绵羊毛囊中的表达模式的分析。利用免疫组化检测五个差异表达基因编码的蛋白在西藏羊毛囊中的表达模式,检测结果发现,WNT5A、MMP1在毛囊的外根鞘中表达,SOX2在毛囊的外根鞘、内根鞘和结缔组织鞘中表达,FGF7在毛囊的毛乳头、毛母质、前体、外根鞘和和髓质层中表达,EGR1在毛囊的毛乳头、毛母质、前体、外根鞘和内根鞘中表达。(4)STK36介导BMP信号通路调控小鼠和绵羊毛囊分化的研究。免疫荧光染色检测发现Stk36、Smurf1在第7天(生长期)小鼠毛囊的毛母质、前体以及内根鞘中表达较强,而BMP信号通路的下游因子pSmad5在上述细胞的细胞核中不表达,表明BMP信号通路未被激活。其次,Stk36、Smurf1在第21天(退行期)和第28天(休止期)小鼠毛囊的毛芽、外根鞘中表达较弱,而pSmad5在上述细胞的细胞核中表达较强,表明BMP信号可能被通路激活。另外,STK36、SMURF 1和pSMAD5在生长期向退行期转换的绵羊毛囊中的表达模式和在小鼠退行期的毛囊中的表达模式相似,推测STK36可能通过介导BMP信号通路调控毛囊细胞的分化。(5)PDGF-BB激活ERK信号通路调控毛母质细胞增殖的研究。qPCR检测发现PDGFRβ在各毛囊细胞间差异表达,利用生长因子PDGF-BB刺激毛母质细胞后显著引起毛母质细胞增殖,并且PDGFRβ及ERK1/2的磷酸化水平均被提高。结果表明PDGF-BB可能通过磷酸化其受体PDGFRβ,然后激活ERK信号通路,进而调控毛母质细胞的增殖。2.毛囊组织特异型启动子活性的鉴定本研究成功构建了毛囊组织特异型启动子KRTAP3-3调控绿荧光蛋白pZsGreenl-1表达的载体,并利用转基因技术在小鼠个体水平验证KRTAP3-3基因启动子活性,结果表明,在转基因阳性小鼠毛发中有较强的点状的绿荧光蛋白信号表达,说明绵羊毛囊组织特异型启动子KRTAP3-3可以驱动外源基因在小鼠毛发中表达。综上所述,本研究从人毛乳头细胞、毛母质细胞和内根鞘细胞中筛选细胞之间的差异表达基因,并分析差异表达基因在绵羊周期性生长毛囊中的表达模式,推测其可能对毛囊增殖及分化具有调控作用,并发现可能的调控通路,为以后的绵羊毛囊的育种提供了依据。同时本研究在小鼠个体水平验证了毛囊组织特异型基因KRTAP3-3的启动子能够驱动外源基因在小鼠毛发中表达,为今后利用转基因技术改良绵羊毛发性状提供了工具。