一、研究背景与目的早发性卵巢功能不全(Premature Ovarian Insufficiency,POI)是指女性40岁之前,原发性或继发性闭经至少4月(排除妊娠后),血清性激素水平低下(主要是E2)、抗苗勒氏管激素降低,和促性腺激素水平升高(主要是FSH),伴随生育力的丧失。随着社会经济的快速发展,职场女性精神压力剧增,加至基因、环境因素的综合影响,POI的发病率呈上升趋势。POI患者由于功能性卵泡的丧失,面临不育、更年期综合征等一系列健康问题,也提高了心血管疾病,骨质疏松骨折、老年痴呆等老年退行性疾病的易感性,严重影响女性的生存质量。POI的发病机制非常广泛,包括染色体基因异常、自身免疫病多器官受累、代谢因素、感染和医源性因素等。不同于自然状态的更年期,约500%的POI患者卵巢功能不可预知,约5%~10%的患者,在诊断POI后,仍然可以妊娠、分娩。大约650%的POI患者属于特发性,无病因可循,而且在出现临床症状之前,卵泡耗竭已经发生。故探索卵泡衰竭的分子机制,了解卵子发生、凋亡闭锁的机理,可为临床pOI的治疗策略提供新思路。哺乳动物的卵子发生是一个循序渐进的过程,经历复杂的形态变化和细胞分化。由初级卵母细胞经过-一系列减数分裂和形态变化,形成成熟卵子的过程称为卵子发生。卵泡生长指静止休眠状态的始基卵泡,被募集选择,发生一系列生化和形态变化,直至卵泡成熟,周期性排卵或卵泡凋亡闭锁。当获能的精子穿透次级卵母细胞透明带,产生顶体反应,卵母细胞迅速完成第二次成熟分裂,卵原核和精原核的染色体融合,形成二倍体的受精卵。GCs及卵泡膜细胞对正常卵子发生至关重要,卵泡数量不足或卵泡凋亡闭锁加速,将导致POI。然而,参与卵子发生过程中的一些信号通路,尤其是一些新的信号转导通路及其调节机制仍不明确,探索这些信号通路在卵子发生,以及POI中的分子机制仍将是今后研究的热点。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mechanistic target of rapamycin,mTOR)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可接受并整合细胞内和细胞外的各种信号通路的刺激,如激素、生长因子、营养、能量代谢等,进而调节蛋白质的翻译、细胞的生长、存活、自噬与代谢等生理过程。在细胞内,mTOR以mTORC 1/2两种复合物的形式存在,其形态结构和功能的改变,与复合物存在的形式有关。而且二者在功能上截然不同,分别接受各自的上游蛋白信号,调节各自下游蛋白的生理功能。其中,mTORC1的活性能特异性地被雷帕霉素所抑制,mTORC2中含有雷帕霉素不敏感的组分Rictor,故其活性不受雷帕霉素的影响。关于Rictor蛋白的结构及各结构域的作用与上、下游的调节机制了解较少,目前认为Rictor/mTORC2可磷酸化Akt(Ser473),促进细胞存活与调节细胞骨架重组。mTORC2在卵泡发育与POI中的作用及调节机制亦不清楚,最近有研究发现去氧乙烯基环己烯(4-vinylcyclohexene diepoxide,VCD)在诱导卵泡大量凋亡的同时,能抑制卵泡中PI3K信号通路的活性。VCD是生产杀虫剂、灭火剂、塑料和橡胶等的中间产物,由于其具有严重的卵巢毒性,会导致女性POI而丧失生育能力。我们在前期的工作中发现4-VCD在导致POI的同时,抑制了 Rictor/mTORC2信号通路的活性,但Rictor/mTORC2在卵泡发育与POI发生中的作用及调节机制尚不清楚。本课题通过Cre-loxP重组酶系统,构建卵泡特异敲除Rictor的小鼠为模型,结合4-VCD导致POI动物模型,应用组织学,胚胎学及细胞分子生物学方法,从分子、细胞与整体水平阐明mTORC2在卵子发育和成熟、卵泡凋亡闭锁、卵巢功能及早期胚胎发育中的作用,并探讨其可能的调控机制,为卵子发生的调节机制和POI的发病机制提供新内容,为女性POI相关疾病的防治提供实验依据和潜在的治疗靶点。二、研究方法1、应用Cre-IoxP系统(Rictor-loxp、ZP3-cre)构建卵泡细胞特异性Rictor基因敲除小鼠。应用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行小鼠基因型的鉴定,用western blot和免疫组织化学确定基因敲除效果。2、通过HE染色、免疫组织化学以及免疫荧光技术分析Rictor/mTORC2对小鼠子宫大小,卵巢组织形态和各级卵泡和黄体数量的影响。3、通过TUNEL检测Rictor/mTORC2对小鼠卵泡发育凋亡闭锁的影响。4、通过酶联免疫吸附测定(ELISA)对敲除小鼠血液进行生化分析,检测Rictor/mTORC2对小鼠血清性激素变化的影响。5、通过流式细胞技术检测Rictor/mTORC2对小鼠卵母细胞细胞周期的影响。6、通过免疫荧光技术、western blot技术、Pulldown以及免疫共沉淀技术分析Rictor/mTORC2对卵泡凋亡和卵巢内分泌、胚胎发育的影响及相关的分子机制。7、通过给予正常小鼠4-VCD处理,建立POI动物模型,探讨Rictor基因在此模型中的作用。三、研究结果1 4-VCD破坏早期卵泡发育,并且抑制卵泡Rictor/mTORC2信号通路的活性为了探讨mTORC2在POI中的作用,首先在4-VCD处理后的卵巢种对mTORC2信号通路的中心成分Rictor的活性进行检测。与对照鼠相比,VCD处理的小鼠中始基卵泡的数量减少了45%,初级卵泡减少了55%,但VCD对更高级的卵泡作用很微弱,对照组与处理组之间基本相近。有趣的是,在VCD处理过的卵巢中,Rictor的一种活性抑制状态——磷酸化Rictor(p-Rictor,Thr-1135)的表达水平明显上升。众所周知,Rictor作为mTORC2的核心组分通过在各种环境下磷酸化并活化Akt,并通过Akt磷酸化并抑制作为细胞凋亡转录因子Foxo3a的活性来促进细胞的存活。与预期的相一致,VCD处理后,卵巢中p-Akt(Ser-473)和p-Foxo3a(Ser-253)的表达量减少了。与此同时,三种经典的促凋亡蛋白Bad,Bax和cleaved-PARP的表达量明显上升。作为SGK1的活性指标,NDGR1在Thr-346位点的磷酸化在对照组和VCD处理组小鼠的结果很接近,这说明mTORC2的另一种下游底物血清-糖皮质激素诱导型蛋白激酶1(SGK1)并没有改变。另外,我们发现S6K1的活性(p-S6K1,Thr-389)表达量反而上升。这些结果与前人报道的体内结果一致,S6K1介导Rictor Thr-1335位点的直接磷酸化,进而抑制S6K1的活性,形成了一个依赖于mTORC1并针对mTORC2的抑制反馈回路。Rictor的磷酸化与失活在VCD介导的卵泡凋亡中可能发挥重要作用。2卵母细胞中Rictor基因的缺失模拟POI的表型为了进一步阐明Rictor/mTORC2对卵泡存活的作用,应用Cre-loxp系统成功构建了卵母细胞特异性敲除Rictor的小鼠。与所预期的一样,在同窝的对照组小鼠的卵泡中检测到了 Rictor的表达,而在敲除小鼠内并没有发现,这说明Cre酶成功实现了对Rictor基因的重组,卵泡细胞特异性敲除Rictor的小鼠构建成功。同时,Rictor基因的缺失也引起了 p-Akt(Ser-473)表达量的降低。有趣的是,mTORC1的下游靶蛋白p-S6(S235/S236)的表达明显减少,这个现象在黄体中尤为明显。以往的研究表明,mTORC2通过激活Akt进而抑制mTORC1的负调控因子(TSC1/2)来活化mTORC1,由此可见,我们的研究结果与以往报道的结果高度一致。我们进一步检测了 Rictor/mTORC2信号通路下游蛋白的表达。Rictor的缺失引起了 p-Foxo3a的表达减少,同时,Bad,Bax和cleaved PARP表达增多。免疫组化的结果也通过Western Blot分析得到了证实。由此可见,卵母细胞中特异性敲除Rictor所引起的控制卵泡生存的潜在信号通路的变化与VCD基本一致。这些结果一致表明Rictor在mTORC2/Akt/Foxo3a/促凋亡蛋白信号轴调控卵泡凋亡过程中的起着核心作用。3卵巢中Rictor缺失引起卵泡细胞凋亡和卵泡丢失随后,我们检测了敲除小鼠中卵泡的数量。敲除小鼠的外形和体格生长发育正常,但子宫则较对照鼠小,在8月龄时,子宫重量只有对照鼠的45%(p<0.05)。随后对敲除小鼠的卵巢进行形态学观察,发现健康卵泡和黄体的数量均明显减少,同时闭锁卵泡明显增多,这一结果与促凋亡蛋白的过度表达是相吻合的。需要引起注意的是,在8月龄的敲除小鼠中,卵泡数量很少,几乎很难观察到。为了更精确地判断Rictor基因敲除对卵泡减少的影响,我们对每个卵巢选取了 5张切片,对不同发育阶段的卵泡进行了分类和计数。与对照鼠相比,6月龄时,条件敲除小鼠的健康卵泡减少了 40%,黄体减少了 50%。至8月龄时,敲除小鼠的健康卵泡减少了 67%,黄体减少了 71%(p<0.001),这表明卵泡细胞缺失Rictor基因,导致卵巢出现卵泡渐进性丢失。众所周知,排卵后残留的卵泡壁塌陷,卵泡膜的结缔组织、毛细血管等伸入到颗粒细胞(GCs)层,在LH作用下演变成体积较大,富含毛细血管并具有内分泌功能的黄体。黄体中GCs占大多数,黄体数量的减少意味着排卵的减少,或者提示可供发育成熟并排卵的卵泡储备不足。造成这种现象的原因可能是由于卵泡的过度耗竭,使得窦前卵泡到窦状卵泡、成熟卵泡的发育过程受阻所致。结合实验结果来看,过度的卵泡凋亡可能是更主要的因素,我们发现在敲除小鼠的卵巢中检测到了更多的闭锁卵泡(p<0.01)。为了进一步确定卵泡耗损具体发生在卵泡发育的哪个阶段,我们进一步分析了各个发育阶段卵泡的数量。尽管相对于对照鼠,敲除小鼠小卵泡(包括始基卵泡和初级卵泡)的数量降低,但是差异并不明显。前人的研究已经证实Zp3-Cre介导的基因敲除发生在初级卵泡以及其之后的发育卵泡的卵母细胞上,从常理上讲,卵泡中Rictor基因的缺失应该不会引起始基卵泡的大量损失,这与实际上观察到的结果是相吻合的(p<0.01)。此外,在8月龄的条件敲除小鼠的卵巢中观察到了窦卵泡和成熟卵泡的大量凋亡,这一结果与条件敲除小鼠卵巢中促凋亡蛋白表达水平显著上调的结果是一致的。以上结果表明,卵巢中Rictor基因的缺失促进了卵母细胞的凋亡,从而引起卵泡的大量耗损,由此导致卵巢储备功能降低。4卵母细胞内Rictor敲除导致小鼠生育能力下降通常情况下,卵泡储备的下降会导致雌鼠生育能力的下降。为了进一步检测条件敲除小鼠的生育能力,我们分别将4、6、8月龄的对照小鼠和敲除小鼠与已被证实有生育能力的野生型C57雄鼠进行交配。正如所预期的一样,敲除小鼠随着年龄的增大,生育能力下降。所有对照小鼠均成功妊娠,并正常分娩幼崽,然而在敲除小鼠组,4月龄和6月龄组内各有1只(11%)在为期两个月的观察期内未能成功受孕。更严重的是,所有8月龄的条件敲除小鼠都出现不育。值得注意的是,来自4月龄组的1只小鼠(11%)和来自6月龄组的4只小鼠产褥期死亡,同时伴发稽留流产和死胎。并且,在敲除小鼠组,成活的幼崽数明显比对照组的少,成功分娩率较对照小鼠降低。因此,敲除小鼠的生殖能力随着年龄的增长而下降,而且自8月龄开始出现不育。5卵母细胞内Rictor敲除小鼠的激素分泌异常作为生殖腺,卵巢在很大程度上受促性腺激素(如FSH和LH)的调节,同时分泌性激素(如E2、P4)。因此,我们检测了敲除小鼠的性激素水平。敲除小鼠FSH和LH的水平都比对照鼠相应的激素水平高,但差异并没有统计学意义(p>0.01)。考虑到敲除小鼠出现卵泡发育的阻滞和不排卵的表型,并且因为FSH促进卵泡发育,LH调节排卵,所以这些变化可能预示着存在某种正反馈效应。与此相反,敲除小鼠的雌二醇和孕酮的分泌都明显下降(p<0.01),尤其是孕酮,与对照鼠的孕酮水平相比几乎减少了一半(p<0.05)。黄体是雌性体内雌二醇的重要分泌源和孕酮的唯一来源,敲除小鼠卵母细胞凋亡,成熟卵泡减少,排卵减少,功能性黄体减少,自然引起性激素分泌的不足,间接导致了生育能力的下降。6来自于母本的Rictor基因对胚胎发育来说可能是非必需的因为Zp3-Cre介导的基因重组特异的发生在卵母细胞中,所以,它不仅是一个非常好用的工具,用于研究目的基因在卵子生成过程中的生理功能,还被广泛的用于探索胚胎发育期间母系遗传的影响。最近一项研究利用破坏多等位基因的方法使Rictor基因失活,发现mTORC2对胚胎生长和发育发挥重要的作用。为了进一步明确来自母本的Rictor基因对胚胎发育是否必需,我们将性成熟的雌性敲除小鼠(Zp3-Cre+,Rictorloxp/loxp 排卵后的卵母细胞细胞缺失Rictor基因)和对照小鼠(Zp3-Cre-,Rictorloxp/loxp正常的卵母细胞)与具有生育能力的野生型C57雄鼠交配。在这个交配组合中,来自于条件敲除小鼠卵泡细胞的胚胎缺少母系遗传的Rictor基因,产生具有-/Rictor基因型的胚胎。但是我们并没有观察到对照小鼠和敲除小鼠胚胎之间有任何明显的解剖或组织学上的差异。虽然在每个特定观察时间点(E5,E10,E15)条件敲除小鼠的胚胎数目较对照组少,但是在整个观察期中(E5到E10),对照组和条件敲除组小鼠胚胎的总数分别保持相对稳定,在E5时,对照组是57个胚胎,敲除组是45个,比对照少。同样,其它两个时间点也是如此。但对于敲除组来说,从45到41,再到42,从时间点的变化上看数量相对稳定,也就是在胚胎发育过程中胚胎并没有明显减少,不会在发育过程中因为胚胎异常而死亡。而每个时间点胚胎数量减少是因为卵泡过度凋亡,卵巢排卵少导致的。这证明母系遗传的Rictor基因缺陷对正常胚胎发育没有影响。此外,对照鼠和敲除小鼠的胚胎在每个时间点的平均数量很接近。除此之外,组织形态学分析显示条件敲除小鼠E16的胎盘并无没有明显的形态学和组织学异常,而且滋养层细胞的标志蛋白-胎盘催乳素(PL-1),与对照小鼠的表达和分布基本一致。尽管条件敲除小鼠死胎发生率增加,但是幼崽外观并没有任何明显的发育缺陷。但是对照鼠和条件敲除小鼠的子宫组织学差异显著,条件敲除小鼠子宫腔的体积更小,而且分泌腺也明显减少,这些子宫组织形态学的异常很容易导致胚胎丢失。这些结果表明,仅仅具有父系遗传的Rictor基因对于整个胚胎发育过程已经足够了。综上所述,4-VCD破坏早期卵泡的发育,并且抑制Rictor/mTORC2信号通路的活性,小鼠卵泡中Rictor基因缺失,导致PO1,主要表现为过度的卵泡凋亡和闭锁,进而导致小鼠生育力的下降,敲除小鼠的FSH和LH水平比正常对照鼠的高。来自于母本的Rictor基因对胚胎发育来说可能是非必需的。四、结论1、在VCD诱导的小鼠POI模型中,Rictor/mTORC2信号通路的活性下降;2、成功构建了卵泡特异性敲除Rrictor的条件基因敲除小鼠模型;3、卵泡中Rictor基因缺失引起引起小鼠卵泡过度凋亡和闭锁,出现POI的表型;4、Rictor在mTORC2/Akt/Foxo3a/促凋亡蛋白信号轴调控卵泡凋亡的过程中起核心作用;5、卵泡Rictor基因敲除的小鼠生育力下降;6、来自于母本的Rictor基因对胚胎发育来说可能是非必需的。综合上述,本研究发现Rictor/mTORC2在卵子发生、卵泡细胞存活与维持雌性生殖能力中起重要作用,卵泡特异性敲除Rictor的小鼠是研究POI的理想模型。