基于多肽的全合成基质用于NSCs体外培养的方法及机制研究

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背景与目的:  神经干细胞(neural stem cells,NSCs)在生物医学领域具有巨大的应用前景。细胞培养和质量控制的标准化是当前干细胞研究及临床转化所面临的关键问题。采用配方明确,无动物源性和无人源成分的培养基质是实现干细胞研究标准化的关键环节。培养基质在体外模拟细胞外基质,不仅为包括NSCs在内的干细胞体外培养提供必要条件,而且在干细胞的生命活动调控中起到极其重要的作用。理想的培养基质产品不仅应当具有明确的成分,而且应当具有明确的功能。细胞与培养基质的相互作用通常是由ECM的某些多肽序列与细胞表面受体结合而引发,整合素是其中一个重要的跨膜受体家族,对其功能的研究有助于我们深入理解细胞-ECM相互作用对干细胞生命活动的影响,以及开发功能特异性的培养基质产品。目前多种整合素亚型的特异性结合多肽序列已经被识别并合成,为研究干细胞中整合素功能提供了有力的工具。  本实验拟利用具有高生物活性的全合成多肽在乙烯砜功能化表面形成绕圈状结构,建立一种能够用于NSCs体外培养的全合成涂层体系;进而利用这一体系构建整合素结合多肽阵列,研究非生物源性的全合成多肽基质支持NSCs生长的相关机制,并建立一种筛选特异性多肽全合成基质的技术;最后我们将利用该阵列建立用于人诱导性多功能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)及iPSCs源性神经上皮祖细胞(neuroepithelial precursors,NEPs)体外培养的全合成基质。  方法:  1.利用乙烯砜(Vinyl Sulfone,VS)基团表面改性的培养容器接枝巯基化的绕圈状全合成IKVAV多肽,建立全合成基质涂层体系,评价hNSCs在全合成基质上的粘附、增殖、分化情况,并与传统的层粘连蛋白(laminin,LN)基质涂层进行比较。  2.利用VS功能化的全合成基质涂层体系构建整合素结合多肽阵列,检测不同的整合素-多肽的特异性结合对NSCs粘附、增殖和分化的影响。  3.利用整合素结合多肽阵列分析iPSCs和iPSCs源性NEPs的粘附、增殖情况,筛选出适合iPSCs和iPSCs源性NEPs粘附、增殖的多肽。  结果:  1.IKVAV多肽在VS功能化表面形成稳定的绕圈状结构,支持hNSCs的粘附、增殖以及分化,细胞培养效果达到或优于传统的LN基质涂层;hNSCs在全合成基质涂层上能够粘附、自我更新和长期传代并保持分化潜能;全合成基质涂层在室温下保存一年仍然保持对hNSCs粘附、增殖的支持作用。  2.hNSCs在16种整合素结合多肽中的12种表面能够实现粘附,自我更新和传代;hNSCs在不同多肽表面的增殖速度存在差别,其中在α5β1,αⅤβ1,αⅡbβ3三种结合多肽表面增殖速度较快;不同整合素-多肽特异性结合对hNSCs分化的作用存在显著差异。  3.iPSCs在α5β1结合多肽表面能够粘附形成克隆、快速增殖并经诱导分化得到NEPs,NEPs同样能够在α5β1结合多肽表面实现自我更新及扩增。  结论:  1.成功构建基于高活性绕圈状IKVAV多肽的全合成基质用于hNSCs的体外培养。  2.整合素-多肽的特异性结合能介导并影响hNSCs的粘附、增殖及分化,是hNSCs在基于多肽的全合成基质表面生长的重要机制。  3.基于α5β1整合素结合多肽的全合成基质能够支持iPSCs及iPSCs源性NEPs的体外培养。
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