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食管癌是环境相关性肿瘤,在认识其复杂病因的过程中,亚硝胺类物质暴露是较早确定的危险因素之一。近年来越来越多的证据显示,食管癌的发生发展还与人类乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染密切相关。本研究在淮安食管癌高发区应用病例-对照研究,检测淮安地区人群血浆HPV感染情况,分析HPV感染与食管癌的关系,确定淮安地区食管癌患者中主要HPV感染型别,进一步以人食管上皮细胞Het-1A为靶细胞,在细胞水平验证HPV主要感染型别协同MNNG是否导致食管上皮细胞恶性转化和对细胞生物学功能变化的影响,初步探讨miR-218在参与HPV协同亚硝胺联合作用的可能分子机制。1.淮安食管癌高发区人群HPV感染情况(1)在江苏淮安地区按照1:1配对募集病例对照样本60对,应用ELISA技术检测血浆HPV水平,发现病例组血浆HPV含量1.060(0.436～2.212)nmol/L,显著高于对照组 0.756(0.471～1.111)nmol/L(Z=2.643,P=0.008),进一步对 HPV 感染率与食管癌发病风险的关联性分析表明,病例组HPV感染率26.67%高于对照组11.11%(P<0.05),HPV感染可显著增加食管癌的发病风险(OR=3.273,95%CI:1.181～9.069)。(2)应用巢式PCR对淮安地区确诊的105例食管癌患者癌组织DNA样本中HPVL1保守区扩增,结果显示癌组织DNA中HPV阳性率31.4%;HPV阳性样本进一步HPV基因分型检测,HPV18亚型感染占全部HPV感染者的24.2%(8/33),其他型别未能检出。2.HPV18协同MNNG致Het-1A细胞恶性转化的作用(1)通过慢病毒载体介导构建Het-1A细胞HPV18-E6E7稳定表达株,通过QRT-PCR和Western Blot检测HPV18 E6和E7 mRNA及蛋白的表达情况,转染组表达量显著高于对照组。(2)以 0μmol/L、0.625lnmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、l0μmol/L、20μmol/L、40μmol/L MNNG浓度分别对HPV18转染组和空载体对照组细胞进行染毒12h、24h、48h,MTT检测细胞毒性发现,MNNG暴露对照组细胞细胞抑制率随染毒剂量增加而增加;MNNG作用于HPV18转染组时细胞OD值均高于空载对照组细胞OD值。(3)以 0μmol/L、0.625μmol/L、2.5μmol/L、10μmol/LMNNG 处理对照组细胞发现MNNG能促进细胞凋亡,G1期细胞比例增加;HPV18转染组细胞S期细胞增加,抑制细胞凋亡;MNNG处理HPV18转染组细胞使G2期细胞比例随染毒浓度增高而增加。(4)HPV18与MNNG联合作用诱导食管上皮Het-1A细胞恶性转化实验结果显示,细胞培养至第25代时,出现细胞恶性转化的特征,细胞变得松散,大小不一,呈多方向排列;ConA凝集实验显示细胞凝集能力明显增强;平板和软琼脂克隆实验结果显示克隆形成率较单独作用组显著增高。(5)CCK8检测细胞增殖能力结果显示,第25代各处理组细胞增殖能力有差异(F=7.919,P=0.004),多重比较结果显示对照组OD值最低(P<0.05),其他各组之间无统计学差异(P=0.173);细胞周期检测结果显示,与对照组相比,HPV18单独作用与MNNG单独作用组25代细胞G1期增高,S期细胞比例降低;MNNG与HPV18联合作用与单独作用相比S期细胞比例显著增加;25代各处理组细胞凋亡率之间有统计学差异,HPV18与MNNG联合作用组细胞凋亡率低于MNNG单独作用组和对照组(P<0.05)。(6)细胞迁移能力检测发现,各组之间细胞迁移率无差异(F=-0.655,P=0.289);侵袭结果显示,MNNG与HPV18联合作用组细胞穿膜数高于各单独作用组和对照组(P<0.05)。3.miR-218参与HPV18协同MNNG致Het-1A细胞恶性转化的机制研究(1)在病例-对照研究结果显示,病例组血浆miR-218表达量低于对照组(P<0.05),血浆中miR-218与食管癌发病风险的关联性分析表明miR-218表达下调与食管癌的发病风险显著相关(OR=0.276,95%CI:0.152～0.501);血浆HPV水平与miR-218表达量呈负相关(P<0.01)。(2)HPV18协同MNNG诱导Het-1A细胞恶性转化模型中miR-218的表达量检测结果显示,各处理组表达量均低于对照组,其中联合作用组最低(P<0.05);进一步分析miR-218相关功能蛋白的表达发现,HPV18与MNNG联合作用组ROBO1、CDK6、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表达均显著上调,提示miR-218可能参与了 HPV18与MNNG联合致癌的过程,影响细胞周期,凋亡和侵袭功能;联合作用组细胞p53表达下调,c-Myc表达上调,提示HPV18与MNNG联合作用可能通过抑制p53对c-Myc转录调控,促进细胞恶性转化。本研究得到以下初步结论:1.HPV感染与淮安地区食管癌发病风险增加相关,HPV18为淮安食管癌患者癌组织中的主要感染型别。2.HPV18与MNNG可协同促进食管上皮细胞恶性转化,抑制细胞凋亡,促进细胞增殖和侵袭能力。3.HPV18和MNNG联合作用致食管上皮细胞恶转可影响miR-218及相关功能蛋白的表达,提示miR-218可能参与HPV18协同MNNG诱导食管上皮细胞恶性转化的作用。