MOFs载体固定化脂肪酶制备及用于芳基丙酸动力学拆分的研究

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光学纯芳香丙酸及其衍生物是工业上合成一系列重要手性药物的关键中间体,同时在农业化学品、食品添加剂、香料等工业领域也有重要应用。酶法动力学拆分具有选择性高、反应条件温和、污染小等优势,是工业制备光学纯芳香丙酸的主要方法之一。但目前酶法动力学拆分在广泛使用中存在游离酶稳定性差、难以实现循环利用以及产物难提纯等难题。本论文针对上述难题,以金属有机框架化合物(metal–organic frameworks,MOFs)为固定化载体,深入研究脂肪酶固定化及应用,为上述难题探索解决途径。以南极假丝酵母脂肪酶(CAL-A)为生物催化剂,筛选出疏水性材料沸石咪唑骨架材料(ZIF-8)为载体,通过吸附法制备固定化酶CAL-A@ZIF-8,并通过粉末X-射线衍射仪(XRD)、热重分析仪(TGA)、氮吸附比表面积测试仪(BET)、傅立叶红外光谱仪(FT-IR)、扫描电子显微镜(SEM)分析载体材料和固定化酶的组成和结构。结果显示ZIF-8上CAL-A的负载量为227 mg/g(MOF),将固定化酶应用于酶催化酯水解卡洛芬甲酯对映体((R,S)-CPME)动力学拆分体系。结果表明,疏水性载体的界面激活作用显著提高了CAL-A酶的催化效率,在固定化酶CAL-A@ZIF-8的催化下,(S)-CP产率(YS)得到了显著提高。在最佳条件下反应48 h,固定化酶CAL-A@ZIF-8催化获得的YS为90.62%,对映体过剩量(eep)为97.55%;相同条件下以游离CAL-A作为催化剂获得的YS为59.79%,eep为92.61%。该固定化酶重复使用三次后,YS为41.54%,eep为96.65%。针对吸附法循环使用性能不足,本章进一步研究了共价连接法中的沉淀共价法固定褶皱假丝酵母脂肪酶(AYS),以及MOFs载体类型对固定化酶性能的影响。以戊二醛作为功能剂,筛选出UiO-66-NH2为固定化载体,通过沉淀共价法制备固定化酶AYS@UiO-66-NH2,并对固定化材料和固定化酶进行系列表征。构建了固定化酶立体选择性催化水解2-(4-甲基苯基)丙酸甲酯对映体((R,S)2-(4-MP)PPAME)动力学拆分体系,研究了底物初始浓度、温度、p H及时间对拆分性能的影响并进行了条件优化。结果表明AYS@UiO-66-NH2比游离AYS具有更高的热稳定性和p H耐受度,在最佳条件下反应24 h后,(R)-2-(4-MP)PPA的产率(YR)为72.56%,eep为93.20%。AYS@UiO-66-NH2重复使用四次后,性能几乎没有损失,反应重复六次后,YR仍保持初始值的53.57%,eep保持基本稳定。针对共价连接法易导致酶构象破坏从而影响酶的催化性能的问题,本章采用水溶性大分子聚乙二醇(PEG)对酶分子修饰,提高酶在共价连接法固定过程中的结构稳定性,并利用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)绿色环保的功能剂实现酶的固定化。以CAL-A酶为目标生物催化剂,筛选出UiO-66作为固定化载体,通过EDC/NHS共价连接法制备固定化酶PEG-CAL-A@UiO-66,测定CAL-A固载量为265 mg/g(MOF),并对其结构进行了表征。该固定化酶应用于2-苯基丁酸己酯((R,S)-2-PBAHE)对映体的水解拆分的结果表明,在最适条件下反应24 h后,相比于同等用量的游离酶,PEG-CAL-A@UiO-66展现了优异的催化性能。在PEG酶修饰和EDC/NHS共价连接固定化作用下(S)-2-PBA的产率(YS)和eep明显提高,分别为91.71%和99.99%。此外,CAL-A经固定化后,热稳定性和p H耐受度显著提高,并具有良好的重复使用性能,重复使用3次后YS几乎没有损失,重复使用5次后,仍能保持初始YS的47.16%。
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