荧光法由于其具有选择性好、灵敏度高、快速简便等优点，近年在生物学、化学及医学领域，针对细胞内生物活性小分子检测得到了广泛应用。但是目前荧光分析法大多通过单个发射峰强度的增加或降低来达到检测目的，这种方法容易受到外界条件的巨大影响，而出现假阳性结果。比率荧光法是用不同位置的两个发射峰强度的比值来检测，这样可以避免如探针浓度、光源强度的波动、仪器的灵敏度等引起的检测误差，因此可以提高方法的选择性、灵敏度和检测范围，尤其是同一激发不同发射的荧光比率探针可以更进一步降低分析方法的误差。荧光比率探针通常需要双荧光的产生，产生双荧光发射的方法有两种，双发色团与单发色团。双发色团是指两个不同的荧光团各自发射出相应的荧光波长，单发色团是指发光团与待测物反应前后，荧光发射波长或是吸收波长产生了蓝移或红移。目前，对于基于单发色团的荧光比率探针已有大量报道，而对于双发色团的荧光比率探针研究较少，尤其是使用同一激发不同发射的荧光比率探针更为少见。此外，对于双发色团荧光比率探针来说，双发色团之间的连接基团（linker）极其重要，不同的链接对探针的荧光性质影响巨大，因此连接基团的选择是比率探针设计中的重要内容。针对以上对荧光比率探针设计合成的要求，本论文展开了下面两方面的工作：（一）氯离子主要存在于细胞的酸性细胞器内，目前报道的氯离子荧光比率探针都是不同激发的，这些探针也没有做到检测溶酶体内氯离子。同时，连接基团（linker）对于双发色团荧光比率探针有着重要的作用，它对探针的光学性质影响巨大。针对以上问题，本文以6-甲氧基喹啉为氯离子敏感基团，具有定位溶酶体功能的丹磺酰胺作为氯离子不敏感基团，分别利用3个亚甲基、N-亚基哌嗪、卞溴3个不同的链接将两个荧光团连接起来，设计合成了3个同一激发不同发射的检测氯离子的荧光比率型探针。其中以3个亚甲基为链接的探针对氯离子基本没有响应。当连接基团为N-亚基哌嗪时，探针则是随着氯离子浓度的增大，6-甲氧基喹啉部分和丹磺酰胺部分的荧光强度同时降低，其对氯离子的响应情况也不令人满意。而用溴卞为连接基团的探针对氯离子表现出了较好的选择性和较高的灵敏度，并且能够瞬间对氯离子浓度的变化作出响应。6-甲氧基喹啉部分的荧光强度随氯离子浓度的增加而呈线性降低，丹磺酰胺部分的荧光强度保持不变，丹磺酰胺部分与6-甲氧基喹啉部分荧光强度的比值与氯离子浓度呈现良好的线性关系。基于探针probe3良好的选择性和灵敏度，我们成功将探针应用到检测细胞溶酶体内氯离子变化水平。实验结果同时也表明连接基团确实影响着探针的光学性质，这为荧光比率型探针设计时选择最佳的连接基团提供了理论与实验指导。（二）设计合成了一种新型的同一激发不同发射的荧光比率型探针Cyb-Rhod-Tpy用于亚铁离子的检测。探针是将Cyb和Rhodamine通过共价键连接，并在Rhodamine上共价修饰对亚铁离子响应的三联吡啶基团。在同一激发下，Cyb-Rhodamine显示两个区分明显的荧光发射峰，其中Rhodamine-Tpy随着Fe²⁺浓度的增加荧光强度线性降低，Cyb荧光保持不变作参比荧光，从而成功实现对亚铁离子的荧光比率分析。