目的:肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌总数的80%以上。尽管早期手术切除5年生存率可达80%，但大部分患者就诊时已属晚期失去了手术治疗机会。过去30年间，虽然有很多新的化疗药物问世，治疗策略也有很大改进，但患者从中获益甚微。因此，急切需要新的治疗方法出现，其中分子靶向药物的使用具有划时代意义。近十年来，以表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）为靶点的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosin kinase inhibitors，TKIs）如吉非替尼（Gefitinib）、厄洛替尼（Erlotinib）等在有EGFR突变的晚期NSCLC治疗中取得了突破性进展，为众多NSCLC患者带来了福音。然而，令人遗憾的是，仍有约20%有EGFR突变的病人对吉非替尼治疗效果不佳。另外，对EGFR-TKIs初始治疗有效的患者经一段缓解期后又出现疾病进展，即发生继发性耐药。以上结果提示，EGFR突变并非是预测EGFR-TKIs对晚期NSCLC的治疗效果与生存的唯一指标，除EGFR突变之外，可能还有其它分子机制参与了对EGFR-TKIs疗效的调控。细丝蛋白A（filamin A, FLNa）又称为肌动蛋白结合蛋白280（ABP-280）或filamin-1（FLN-1），它的N末端含有肌动蛋白结合区（actin-bindingdomain，ABD），可交联肌动蛋白细丝形成稳定的细胞骨架，有助于细胞的运动；FLNa还可与多种细胞膜蛋白结合，为多种蛋白质之间的相互作用提供平台，参与细胞的增殖、粘附、侵袭、迁移以及肿瘤的发生等过程。为证实FLNa的表达量是否影响非小细胞肺癌对EGFR-TKIs的敏感性，本研究拟通过：（1）采用Western blot检测不同类型NSCLC细胞株中FLNa蛋白的表达水平，分析FLNa表达水平与NSCLC细胞对Gefitinib的敏感性的关联；（2）构建表达FLNa siRNA的质粒，将其转染原本高表达FLNa的NSCLC细胞建立沉默FLNa的稳定细胞株；将含FLNa基因的质粒转染原本低表达FLNa的NSCLC细胞建立过表达FLNa的稳定细胞株；（3）检测在Gefitinib作用下，沉默FLNa和过表达FLNa的稳定细胞株的增殖、迁移和侵袭等生物学行为的变化，探讨改变FLNa表达水平是否影响NSCLC对Gefitinib的敏感性。研究结果将为临床研发克服EGFR-TKIs耐药的新药提供新靶点，为EGFR-TKIs耐药的NSCLC患者的治疗带来新曙光。方法:1不同类型NSCLC细胞FLNa蛋白的表达水平体外培养人NSCLC细胞系：GLC-82、 H1975、A549和PC-9细胞，收集细胞提取总蛋白后，通过Western blot检测各种细胞中FLNa的蛋白表达水平。2Gefitinib对不同类型NSCLC细胞的生长抑制作用将GLC-82、 H1975、A549和PC-9细胞分别接种于96孔板，次日换用含不同浓度Gefitinib的完全1640培养基，继续培养72h后，采用MTT法，测定各孔吸光度（OD）值，计算细胞生长抑制率和Gefitinib的IC50值（细胞生长抑制率为50%时的药物浓度）。3FLNa siRNA重组质粒的构建与鉴定根据GenBank中人FLNa基因已知序列（编号: NM₀01456.3），设计针对FLNa基因的特异性小干扰RNA （small interfering RNA, siRNA）序列，合成能转录短发夹RNA（small hairp in RNA, shRNA）的DNA序列。将DNA序列退火后与质粒载体连接，构建FLNa siRNA重组质粒，阳性克隆经PCR扩增初步鉴定后，再送Invitrogen公司进行DNA测序鉴定。4筛选稳定转染细胞株并验证基因沉默或过表达效果将表达FLNa siRNA的质粒和含FLNa全长基因的质粒分别转染H1975和PC-9细胞，转染48h后分别用嘌呤霉素和潮霉素B筛选３周，挑选出稳定转染的单克隆细胞大量培养。利用实时定量RT-PCR和Western blot检测稳定转染细胞株中FLNa mRNA和蛋白的水平。5Gefitinib对稳定转染细胞株的生长抑制作用将沉默FLNa的稳定转染细胞株（H1975/FLNa siRNA）及其对照组细胞（H1975/Control）和过表达FLNa的稳定转染细胞株（PC-9/FLNa）及其对照组细胞（PC-9/pREP4）分别接种于96孔板，次日换用含不同浓度Gefitinib的完全1640培养基，继续培养72h后，采用MTT法，测定各孔吸光度（OD）值，计算细胞生长抑制率和Gefitinib的IC50值6划痕修复实验检测细胞的迁移能力在24孔板中培养稳定转染细胞株H1975和PC-9生长达80-90%融合度时，用10μl移液器枪头划痕，PBS洗去漂浮的细胞，再加入含Gefitinib的完全1640培养基继续培养，在倒置显微镜下观察并拍照，6h拍照一次，直至划痕愈合，利用软件测量划痕宽度变化。迁移率=（划痕初始宽度－目前宽度）/2/划痕初始宽度×100%。7Transwell检测细胞的侵袭能力铺基质胶于Transwell小室的上室，将稳定转染细胞株H1975和PC-9分别接种于上室，加入含Gefitinib的完全1640培养基继续培养24h后，95%冰乙醇固定，HE染色，显微镜下拍照，每个小室随机选取上、下、左、右及中心共5个视野，计算穿膜细胞数。8在Gefitinib作用下H1975稳定转染细胞株EGFR磷酸化水平的变化培养稳定转染细胞株H1975生长达80-90%融合度时，加入含Gefitinib的完全1640培养基继续培养48h后，收集细胞，提取总蛋白，采用Westernblot检测p-EGFR、EGFR、FLNa的水平，-actin作为内参蛋白。结果：1不同类型NSCLC细胞株中FLNa的蛋白水平Western blot检测结果显示：PC-9细胞的FLNa蛋白水平（0.79±0.02）明显低于GLC-82、H1975、A549细胞（1.40±0.02，1.30±0.02，1.47±0.03），差异有统计学意义（P<0.01）。2Gefitinib对不同类型NSCLC细胞的生长抑制作用MTT检测结果显示：GLC-82、H1975和A549细胞的IC50值（42.20±3.22，21.87±0.84，37.62±2.56）明显高于PC-9细胞（0.05±0.01），差异有统计学意义（P<0.01）。3NSCLC细胞中FLNa蛋白的表达与对Gefitinib敏感性的相关性相关分析显示：NSCLC细胞中FLNa表达水平与其对Gefitinib的敏感性呈负相关。r=﹣0.95, r²=0.91, P<0.05.4FLNa siRNA重组质粒的构建与鉴定构建的重组质粒阳性克隆经PCR结果显示：重组质粒的插入片段大小与预期相符，表明目的DNA序列已克隆入重组质粒中；DNA测序证实该重组质粒序列与所设计序列完全一致，表明针对FLNa基因的siRNA表达质粒已成功构建。5稳定转染细胞株H1975和PC-9中FLNa的表达实时定量RT-PCR检测结果显示：H1975/FLNa siRNA细胞中FLNamRNA的表达（0.44±0.01）明显低于H1975/Control细胞（1.00±0.00）差异有统计学意义（P<0.01）； PC-9/FLNa细胞中FLNa mRNA的表达（3.93±0.81）明显高于PC-9/pREP4细胞（1.00±0.00），差异有统计学意义（P<0.01）。Western blot检测结果显示：H1975/FLNa siRNA细胞中FLNa蛋白的表达水平（0.53±0.01）明显低于H1975/Control细胞（0.91±0.01），差异有统计学意义（P<0.01）；PC-9/FLNa细胞的FLNa蛋白表达水平（0.67±0.01）明显高于PC-9/pREP4细胞（0.40±0.01），差异有统计学意义（P<0.01）。6稳定转染细胞株对Gefitinib的敏感性MTT检测结果显示：加入不同浓度Gefitinib的H1975/FLNa siRNA细胞的生长抑制率均高于相应浓度的H1975/Control细胞，差异有统计学意义（P<0.05）；H1975/FLNa siRNA组Gefitinib的IC50（13.44±1.00）明显低于H1975/Control组（20.43±2.47），差异有统计学意义（P<0.05）；加入不同浓度Gefitinib的PC-9/FLNa细胞的生长抑制率均低于相应浓度的PC-9/pREP4组细胞，差异有统计学意义（P<0.05）；PC-9/FLNa组Gefitinib的IC50（2.12±0.07）较PC-9/pREP4组（0.06±0.04）明显增高，差异有统计学意义（P<0.01）。7在Gefitinib作用下稳定转染细胞株的迁移能力划痕修复实验检测结果显示：H1975/FLNa siRNA组细胞12h、24h、36h的迁移率（5.02±0.61%，2.12±0.10%，7.07±0.10%）明显低于H1975/Control组细胞（26.92±1.26%，41.81±1.50%，50.00±0.00%），差异有统计学意义（P<0.01）。PC-9/FLNa组细胞24h、48h、72h的迁移率（13.06±0.69%，27.34±3.10%，50.00±0.00%）明显高于PC-9/pREP4组细胞（10.96±0.84%，16.16±0.88%，26.16±0.92%），差异有统计学意义（P<0.01）。8在Gefitinib作用下稳定转染细胞株的侵袭能力Transwell cell invasion assay结果显示：H1975/FLNa siRNA组细胞的穿膜细胞数（19.25±3.10）明显少于H1975/Control组细胞（66.50±6.19），差异有统计学意义（P<0.01）；PC-9/FLNa组细胞的穿膜细胞数（71.75±5.56）比PC-9/pREP4组细胞（21.00±2.16）明显增多，差异有统计学意义（P<0.01）。9在Gefitinib作用下H1975稳定转染细胞株EGFR信号通路的变化Western blot检测结果显示：在Gefitinib作用下，H1975/FLNa siRNA组细胞的p-EGFR水平明显低于H1975/Control组细胞。结论：1NSCLC细胞FLNa的表达水平与其对Gefitinib的敏感性呈负相关；2成功构建了FLNa siRNA重组质粒，转染NSCLC细胞后可有效抑制其FLNa mRNA和蛋白水平的表达。3沉默FLNa表达可增强NSCLC细胞对Gefitinib的敏感性，而增加FLNa的表达可降低NSCLC细胞对Gefitinib的敏感性。4沉默FLNa表达可增强Gefitinib对NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用；增加FLNa的表达可降低Gefitinib对NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。5沉默FLNa表达可增强Gefitinib抑制NSCLC细胞EGFR磷酸化的作用。