白菜BrSWEET15在芸薹根肿菌侵染过程中的功能分析

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SWEET(sugars will eventually be exported transporters)是一种广泛存在于真核和原核生物中的糖转运蛋白,一般包含7个跨膜螺旋,形成两个Mt N3/saliva结构域。它们在生殖发育、植物的逆境反应及衰老、植物与微生物的相互作用等多个方面起重要作用。研究发现,白菜Br SWEET基因家族中共有34个成员,定位在1至10号染色体上,参与多个生理生化进程。且病原菌侵染会诱导白菜SWEET转运蛋白的启动,在侵染过程中能提高宿主组织中的糖的运输和调节分配。目前根肿病和菌核病是威胁十字花科农作物的两大病害,二者均能够通过农事活动、流水和土壤等进行传播,且传播速度快,一旦染病便难以根除。由于芸薹根肿菌生活史中具有原生质团阶段,故归类于原生界、根肿菌门、根肿菌纲、根肿菌属。核盘菌是一种常见的兼性寄生性真菌。上述两种病原菌的寄生过程均存在寄主与宿主之间关于糖分的竞争。本论文结合生物信息学手段和分子生物学实验技术,以白菜为研究对象,选定Br SWEET15为目标基因,探究其多拷贝成员在根肿病及菌核病发病过程中的功能,弄清Br SWEET15a、15b和15c在其抗病性形成过程中的分子机理。取得的研究结果如下:(1)芸薹根肿菌侵染后24h和48h的RNA-seq分析。以芸薹根肿菌孢子液侵染的方式对白菜ECD05材料进行根肿病发病实验,分别在侵染后24h和48h获得根部组织,进行转录组测序。有三个比较组:24h CKvs24h I、48h CKvs48h I和24h Ivs48h I,差异表达基因数量分别为4406个、1412个和1253个。KEGG通路的富集分析结果显示,三个比较组中均含有病原菌互作淀粉、蔗糖代谢和植物激素信号转导等富集水平显著的通路。GO分类中DEGs的主要terms有19个,富集趋势差异明显的有免疫系统进程、排毒途径、刺激响应、信号、生长、多生物进程和细胞死亡等。其中,刺激响应、排毒途径和生物粘着是三组共有的差异明显的terms。研究发现,根肿菌侵染后的24 h是寄主机体调节的最活跃时期。荧光定量PCR验证结果显示,34个Br SWEET中的22个家族成员的荧光定量结果和转录组测序的表达变化趋势一致。(2)Br SWEET15a是Br SWEET15的优势表达基因。根据RNA-Seq和qRT-PCR结果,选择Br SWEET15a、15b和15c作为目标基因进行深入研究。分别构建Br SWEET15a、15b和15c的亚细胞定位载体和启动子融合GUS表达载体,分析基因表达功能和启动子活性。另外,使用在线启动子分析软件Plant CARE对Br SWEET15a、15b和15c的三个启动子序列进行结构分析和功能预测。Br SWEET15a和Br SWEET15b被证实在细胞膜上表达与定位,它们的启动子中均具有CAAT-box和TATA-box等核心启动子元件。GUS染色的结果显示,Br SWEET15a启动子具有表达活性。因此,Br SWEET15a是Br SWEET15的优势表达基因。(3)Br SWEET15a的功能分析。构建Br SWEET15a异位表达载体和At SWEET15过表达载体,并进行拟南芥浸花转化。同时,对At SWEET15的TDNA插入突变体进行纯合检测后,对过表达转化株以及突变体纯合株进行根肿菌和核盘菌侵染后的表型观察,结果表明,在根肿菌侵染过程中,虽然过表达的Br SWEET15和At SWEET15与对照组病情差异不明显,但T-DNA插入的拟南芥植株表现出相较于野生型植株更强的感病性。所以,在根肿菌侵染过程中,SWEET15表现为抗性基因。在核盘菌侵染过程中,过表达的Br SWEET15与对照组发病情况没有显著差异,而T-DNA插入的拟南芥植株表现为比野生型拟南芥更加抗病。由此可见,在核盘菌侵染过程中,SWEET15表现为感病基因。因此,根肿菌和核盘菌对植物的侵染过程与分子机制有显著的差异。
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