目的:通过分析一例高胆固醇患者中发现的APOB基因突变位点,结合患者的临床资料及基因检测,追溯患者家族成员的血脂情况,并探讨突变位点c.12581T>C的可能致病机制,为家族性高胆固醇血症（Familial Hypercholesterolemia,FH）的临床诊断提供新的诊断依据。方法:1、资料收集:根据FH常用的诊断评分标准收集患者家系信息,绘制家谱图,采集先证者空腹血样送检,进行全外显子测序,寻找突变位点并进行突变功能及蛋白结构预测。2、位点获取:通过设计包含突变位点的APOB基因截短体片段,根据片段序列设计引物,进行PCR扩增,将扩增产物凝胶电泳,并对条带进行纯化及测序验证。3、质粒构建:构建只表达绿色荧光蛋白GFP基因的空载体质粒、同时表达GFP与LDLR-HA基因的野生型LDLR质粒、同时表达GFP基因和APOB-Flag基因的野生型截短APOB质粒及同时表达GFP基因和APOB-Flag基因的突变型截短APOB质粒。4、质粒转染:通过体外培养人正常肝细胞（HL-7702）,分为三组进行质粒共转染:空载体组（只表达绿色荧光蛋白GFP基因的空载体质粒及同时表达GFP与LDLR-HA基因的野生型LDLR质粒）,WT组（同时表达GFP基因和APOB-Flag基因的野生型截短APOB质粒及同时表达GFP与LDLR-HA基因的野生型LDLR质粒）,Mut组（同时表达GFP基因和APOB-Flag基因的突变型截短APOB质粒及同时表达GFP与LDLR-HA基因的野生型LDLR质粒）培养48h,使各组中的截短APOB蛋白及LDLR蛋白充分表达并结合。5、功能验证:收集各组细胞,提取蛋白后利用琼脂糖珠（Protein G beads）及抗Flag抗体对各组中的截短APOB蛋白进行免疫沉淀,并保留部分蛋白样品为Input组;利用Western blotting方法检测各Ip组中LDLR蛋白的表达情况,以及各Input组中的截短APOB蛋白及LDLR蛋白的表达情况,并使用β-actin做内参。结果:1、通过三代家系研究,筛选出几名可疑FH患者,其中先证者生化常规提示其总胆固醇（TC 9.82mmol/L）和低密度脂蛋白（LDLC 7.59mmol/L）水平明显升高,符合高胆固醇血症特征。2、先证者血样测序结果提示存在两个未报道过的APOB基因突变:c.12581T>C（编码区第12581号核苷酸由胸腺嘧啶变异为胞嘧啶）,导致氨基酸改变p.I4194T（第4194号氨基酸由异亮氨酸变异为苏氨酸）,其位于第29号外显子上,为错义突变;c.4538G>A（编码区第4538号核苷酸由鸟嘌呤变异为腺嘌呤）,导致氨基酸改变p.R1513Q（第1513号氨基酸由精氨酸变异为谷氨酰胺）,其位于第26号外显子上,为错义突变。通过蛋白预测软件预测c.12581T>C可能为致病性突变,突变后I4194与第4190位氨基酸之间增加了一个氢键,可能会影响蛋白的空间结构域。3、设计包含c.12581T>C突变位点的目的基因片段引物,经扩增及测序提示目的片段提取成功。4、构建了包含c.12581T>C突变位点的突变型截短APOB过表达质粒与包含目的序列的野生型截短APOB过表达质粒,测序提示与目的基因m RNA序列对比,突变型质粒构建成功。5、质粒转染后经Image J测量,对三组绿色荧光值进行统计,提示三组细胞转染质粒后基因的表达水平相当。6、Western blotting实验结果提示野生型及突变型截短APOB质粒的Input组可以正常表达截短APOB蛋白和LDLR蛋白;Ip组的突变型截短APOB蛋白的分子量与野生型截短APOB蛋白的分子量相当,蛋白结合水平仅略微降低（P>0.05）,经检验差异无统计学意义。结论:1、通过对一个FH家系的临床病史资料收集,以及对先证者的血脂指标和基因测序分析,发现了两个与FH临床表型高度相关的APOB基因编码区的突变:c.12581T>C和c.4538G>A。两者均能导致氨基酸发生改变,其中突变c.12581T>C可能是引起FH的影响因素。2、通过体外细胞实验成功构建过表达截短体质粒,利用免疫共沉淀技术模拟受体结合结构域上的突变型截短APOB蛋白及野生型截短APOB蛋白分别与LDLR结合,验证了突变位点是否通过影响截短APOB蛋白与LDLR结合能力而致病。3、从截短APOB蛋白的功能上验证了c.12581T>C突变位点未引起APOB基因表达异常,对截短APOB蛋白与LDLR的结合也无明显影响,初步证实该位点不影响截短APOB蛋白的分泌与结合功能。