第—部分 胰腺癌细胞中PP2Ac低表达激活JNK通路促进胰腺癌细胞生长的机制研究目的:探讨蛋白磷酸酶2A催化性C亚基(protein phosphatase 2A catalytic subunit,PP2Ac)在胰腺癌组织和细胞系中的表达水平,及其对JNK/c-Jun/AP-1信号通路的调控作用和对细胞生长的影响。方法:Real-time PCR检测PP2Ac表达水平,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞活力,Western印迹检测蛋白表达水平和磷酸化水平,流式细胞术检测细胞周期,荧光素酶报告基因检测转录活性。结果:胰腺癌组织中PP2Ac表达水平显著低于癌旁组织,胰腺癌细胞系中PP2Ac也呈低水平表达;在胰腺癌细胞中分别过表达PP2Ac α和β两种亚型,转染72 h后可分别使细胞活力下降(33.89±2.05)%、(16.66±2.81)%;胰腺癌细胞中JNK信号通路可被生长因子激活;采用抑制剂SP600125阻断JNK通路,可阻滞细胞周期于G2/M期,SP600125处理72h后使细胞活力下降(31.38±1.33)%,从而抑制细胞生长;PP2Ac低水平表达可上调JNK/c-Jun/AP-1通路的活性,在胰腺癌细胞中分别过表达PP2Acα和PP2Acβ可下调JNK、c-Jun的磷酸化水平,并分别使AP-1转录活性下降(47.18±2.28)%、(30.89±8.09)%。结论:胰腺癌细胞中PP2Ac呈低表达,通过上调JNK/c-Jun/AP-1通路的活性促进胰腺癌细胞生长。第二部分 PP2A抑制剂通过持续过度激活JNK通路抑制胰腺癌细胞生长的机制研究目的研究PP2A抑制剂通过持续激活JNK通路对胰腺癌细胞系PANC-1生长的影响及机制。方法通过四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测细胞生长。Western印迹法检测蛋白表达水平和磷酸化水平。流式细胞术检测细胞周期。RT-PCR及实时定量PCR检测mRNA表达水平,荧光素酶报告基因检测启动子活性。结果碘化丙锭(PI)染色结合流式细胞术证实PP2A抑制剂使细胞周期阻滞在G2/M期,呈剂量依赖效应。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)抑制剂SP600125预处理后,再进行PP2A抑制剂处理,G2/M期比例无明显上升或上升幅度明显下降。光辉霉素A染色结合流式细胞术进一步证实PP2A抑制剂使细胞周期阻滞在G2期,而非M期。蛋白磷酸酶2A抑制剂可上调p21表达,并下调CDK1表达。采用c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路抑制剂阻断JNK通路,可削弱PP2A抑制剂对CDK1表达的下调作用,但不能削弱PP2A抑制剂对p21表达的上调作用。采用p21 siRNA阻断p21信号通路,或采用CDK1抑制剂阻断CDK1通路,均可削弱PP2A抑制剂对细胞生长的抑制作用。通过荧光素酶报告基因,证实JNK通路激活后抑制CDK1基因启动子的转录活性,其作用位于CDK1基因起始位点上游382bp～373bp。结果PP2A抑制剂通过持续激活JNK通路,抑制CDK1表达,使细胞周期阻滞在G2期,进而抑制细胞生长。