【摘 要】
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目的:探讨Rps23rg1基因转录调控机制,明确介导Rps23rg1基因转录的转录起始点及关键启动子结合位点,进而筛选可以调控Rps23rg1基因表达的小分子化合物,为寻找以Rps23rg1为靶点的AD治疗药物研发提供科学依据。方法:本研究采用5’端cDNA快速末端扩增技术确定基因Rps23rg1启动子区域的转录起始点,并对转录起始点上下游区域进行生物信息学分析。根据转录起始位点和生物信息学分析结
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目的:探讨Rps23rg1基因转录调控机制,明确介导Rps23rg1基因转录的转录起始点及关键启动子结合位点,进而筛选可以调控Rps23rg1基因表达的小分子化合物,为寻找以Rps23rg1为靶点的AD治疗药物研发提供科学依据。方法:本研究采用5’端cDNA快速末端扩增技术确定基因Rps23rg1启动子区域的转录起始点,并对转录起始点上下游区域进行生物信息学分析。根据转录起始位点和生物信息学分析结果,将转录起始点上下游约1500bp碱基进行不同长度的截短,并插入pGL3-basic载体中,通过双荧光素酶报道基因检测方法对各截短型片段进行转录活性分析,明确调控Rps23rg1基因转录的关键位点。进一步采用DNAPulldown联合蛋白质谱检测的实验方法,结合生物信息学分析,寻找可能结合在该关键位点的转录因子,并通过抑制剂和荧光定量PCR证实转录因子对Rps23rg1基因的转录调控作用。此外,本研究将含有关键位点的报道基因质粒转染至SH-SY5Y细胞构建稳转细胞,以稳转细胞为基础,通过荧光素酶报道基因检测对1600种小分子化合物进行筛选,寻找可以提高关键位点转录活性的药物,并在细胞和动物水平验证小分子化合物对基因Rps23rg1的影响。结果:（1）通过5’RACE实验确立Rps23rg1基因转录起始点,发现转录起始点位于翻译起始点ATG上游1524bp的G碱基。通过双荧光素酶报道基因检测技术发现+732/+1127区域转录活性明显升高,+1177/+1187区域转录启动子活性明显降低,提示+732/+1127区域存在能够增强启动子活性的转录因子结合位点,在+1177/+1187区域存在抑制启动子活性的转录因子结合位点。（2）将+1167/+1187片段合成为实验探针,+1167/+1177片段合成为对照探针,与核蛋白孵育后进行DNA Pulldown,所得产物进行SDS-PAGE分离,在约25kDa处发现一差异性条带。通过质谱分析并结合生物信息学分析,发现在该条带处含有转录因子Smad3可能与+1177/+1187片段结合。进一步,发现使用Smad3特异性抑制剂Sis3可以提高-1509/+1187的转录活性,并能促进Rps23rg1的mRNA表达,证实Smad3参与Rps23rg1转录调控。（3）将含有关键位点的+732/+1187序列插入pGL-3载体构建成报道基因质粒,同时将不含关键位点的+732/+1127序列插入pGL-3载体构建成对照质粒,并将这两种质粒分别转染至SH-SY5Y细胞中,获得含+732/+1187或+732/+1127的报道基因稳转细胞系。利用稳转细胞系,通过荧光素酶报道基因实验对1600种小分子化合物进行筛选,发现盐酸非那吡啶可以提高+732/+1187转录活性,但对+732/+1127无明显作用。（4）在SH-SY5Y和N2a细胞中加入盐酸非那吡啶可以上调Rps23rg1的表达;腹腔注射和海马内注射盐酸非那吡啶也能够有效增加肾、肝、肺和海马组织中Rps23rg1的表达。结论:（1）转录起始点位于翻译起始点ATG上游1524bp的G碱基。（2）转录起始点下游+1177/+1187区域是抑制Rps23rg1基因转录表达的关键位点。（3）Smad3可能与+1177/+1187关键位点结合,并调控Rps23rg1基因转录表达。（4）盐酸非那吡啶可以上调Rps23rg1基因表达,是一种潜在的AD治疗药物。
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