青蒿素，作为一种有过氧基团的倍半萜内酯类化合物，是一种高效低毒的天然新型抗疟药。对其进行结构改造，可得到双氢青蒿素等衍生物。有研究显示青蒿素类抗疟药具有自身诱导代谢现象，在人体内主要由CYP286和CYP3A4介导代谢，并且对CYP2C19也有诱导。也有研究表明，核受体超家族中的孤儿核受体孕烷X受体(PXR)和组成型雄烷受体(CAR)是介导CYP450诱导的主要调控因子。青蒿素类药物对CYP450的诱导作用是否是通过该类药物对核受体PXR或CAR的激活作用而完成的，目前尚不清楚。本课题拟选择青蒿素类衍生物的母体化合物青蒿素以及该类衍生物的活性代谢产物双氢青蒿素作为代表药物，取对数生长期的人肝癌HepG2细胞为模型，以CYP286、CYP3A4和CYP2C19为考察目标，从药物代谢角度，采用分子生物学方法（Real-timequantitativePCR、WesternBlot），在体外条件下，探讨该类药物对核受体PXR和CAR介导的CYP286、CYP3A4和CYP2C19的诱导作用。　　 (1)青蒿素类抗疟药对HepG2细胞的生长抑制作用　　 以体外培养HepG2细胞为模型，取对数生长期的细胞,分别给予不同浓度的青蒿素(2、5、10、30、50、70、100μM)和双氢青蒿素(1、3、5、10、15、20、25μM)处理，于给药24h、48h、72h后采用四甲基偶氮哗蓝(MTT)法考察青蒿素和双氢青蒿素对HepG2细胞增殖的影响，并计算细胞抑制率及半数抑制浓度IC50，从而建立体外筛选平台。青蒿素和双氢青蒿素作用HepG2细胞48h后，细胞的半数抑制浓度IC50分别为68μM，15μM。本实验选择小于IC50的50、30、10μM作为青蒿素药物的高、中、低剂量组，分别进行不同浓度的考察；选择低剂量组10μM青蒿素作用细胞24h、48h、72h分别进行不同时间的考察。选择小于IC50的10、5、3μM作为双氢青蒿素药物的高、中、低剂量组，分别进行不同浓度的考察；选择低剂量组3μM双氢青蒿素作用细胞24h、48h、72h分别进行不同时间的考察。此外，与溶剂对照组相比，各药物组均不同程度的抑制了正常HepG2细胞的增殖，并且随着药物浓度的增大及作用时间的延长，细胞毒作用增人，表现出明显的时间依赖性和剂量依赖性。　　 (2)青蒿素类抗疟药对HepG2细胞car、pxr、cyp3a4、cyp2b6+cyp2c19mRNA表达水平的影响　　 分别选取10、30、50μM青蒿素和3、5、10μM双氢青蒿素处理对数生长期的HepG2细胞24h，并选取10μM青蒿素和3μM双氢青蒿素分别处理HepG2细胞24h、48h、72h。收集细胞，Trizol一步法提取细胞总RNA，采用实时荧光定量PCR(Real-timequantitativePCR)方法检测其核受体car、pxr及代谢酶cyp3a4、cyp2b6、cyp2c19mRNA，2-ΔΔCt法计算相对定量结果。10、30、50μM青蒿素作用HepG2细胞24h后，car、pxr、3a4、2b6mRNA水平随浓度的增大均不同程度增加，呈明显的剂量依赖性，而2c19则表现不明显；10μM青蒿素作用HepG2细胞48h，相应car、pxr、3a4、2b6、2c19mRNA水平随作用时间的延长均不同程度的增加，继续作用至72h，其mRNA水平则下降。此外，相比溶剂对照组，10、30μM青蒿素处理HepG2细胞24小时后，细胞car、pxr、2b6、3a4、2c19mRNA的表达量均无统计学意义(P＞0.05);50μM青蒿素处理HepG2细胞24小时后，细胞car、2b6mRNA的表达量相对增加(P＜0.05)，上调倍数分别为1.90±0.07,3.16±0.85;pxr、3a4、2c19mRNA的表达量无统计学意义(P＞0.05);10μM青蒿素分别处理HepG2细胞24h、48h、72h后，细胞car、2b6、pxr、3a4、2c19mRNA的表达量均无统计学意义(P＞0.05)。3、5、10μM双氢青蒿素作用HepG2细胞24h后，相应car、pxr、3a4、2b6、2c19mRNA水平随浓度的增大均不同程度增加。3μM双氢青蒿素作用HepG2细胞48h，相应car、pxr、3a4、2b6、2c19mRNA水平随作用时间的延长均不同程度的增加，继续作用至72h，其mRNA水平则下降。此外，相比溶剂对照组，双氢青蒿素组的mRNA表达量均无统计学意义(P＞0.05)。　　 (3)青蒿素类抗疟药对HepG2细胞CAR、PXR、CYP286、CYP3A4、CYP2C19蛋白表达水平的影响　　 分别选取10、30、50μM青蒿素和3、5、10μM双氢青蒿素处理对数生长期的HepG2细胞24h，并选取10μM青蒿素和3μM双氢青蒿素分别处理HepG2细胞24h、48h、72h。收集细胞，BCA法提取细胞总蛋白，采用WesternBlot方法检测其核受体CAR、PXR及代谢酶3A4、286、2C19蛋白表达量。10、30、50μM青蒿素作用HepG2细胞24h后，CAR、PXR、286、3A4、2C19蛋白表达水平随浓度的增大均不同程度增加，呈明显的剂量依赖性。10μM青蒿素作用HepG2细胞48h，相应CAR、PXR、286、3A4、2C19蛋白表达水平随作用时间的延长均不同程度的增加，继续作用至72h，其蛋白表达水平则下降。此外，相比溶剂对照组，10、30μM青蒿素处理HepG2细胞24小时后，细胞CAR、PXR、286、3A4、2C19蛋白表达量均无统计学意义(P＞0.05)；50μM青蒿素处理HepG2细胞24小时后，细胞286的蛋白表达量相对增加(P＜0.05)，上调倍数为1.41±0.27;CAR、PXR、3A4、2C19的蛋白表达量均无统计学意义(P＞0.05);10μM青蒿素分别处理HepG2细胞24h、48h、72h后，细胞CAR、PXR、286、3A4、2C19的蛋白表达量均无统计学意义(P＞0.05)。3、5、10μM双氢青蒿素作用24h后，相应CAR、PXR、286、3A4、2C19蛋白表达水平随浓度的增大均不同程度增加,3μM双氢青蒿素作用48h，相应CAR、PXR、286、3A4、2C19蛋白表达水平随作用时间的延长均不同程度的增加，继续作用至72h，其蛋白表达水平则下降。此外，相比溶剂对照组，双氢青蒿素组的蛋白表达量则均无统计学意义(P＞0.05)。　　 以上实验结果表明，青蒿素和双氢青蒿素在体外对HepG2细胞的增殖有明显的抑制作用，并随浓度的增大和作用时间的延长，细胞毒作用也随之增大。青蒿素组car、pxr、3a4、2b6mRNA的表达量呈现剂量依赖性，2c19mRNA则表现不明显；双氢青蒿素组car、pxr、2b6、3a4、2c19mRNA的表达量呈现剂量依赖性；青蒿素与双氢青蒿素组CAR、PXR、3A4、286、2C19的蛋白表达量呈现剂量依赖性；青蒿素和双氢青蒿素组的mRNA和蛋白表达量在48h内呈现时间依赖性，但是随着作用时间的延长，mRNA和蛋白表达量反而下降，究其原因，认为可能是作用时间延长后药物对细胞的毒性所致。此外，青蒿素能上调HepG2细胞CAR受体mRNA的表达，CYP286mRNA和蛋白表达也被不同程度上调。所以认为青蒿素类药物很有可能是通过激活核受体CAR而实现对CYP286表达的诱导作用的。