复杂海藻多糖降解菌株的分离培养、基因组学分析与活性优化研究

来源 :浙江海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:aeo55121891
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我国海藻资源丰富,但目前海藻行业的产品主要以海藻本身加工为主,应用范围狭窄、经济附加值较低。而海藻多糖可以降解得到具有不同聚合度(Degree of Polymerization,DP)海藻寡糖。海藻寡糖具有抗炎、抗癌、食品保鲜和美白等功能,可以广泛应用于医药、化妆品、保健品、作物肥料和保鲜等领域,进而提高产品的经济附加值。相比于传统的酸水解法,利用微生物法降解海藻多糖具有产物聚合度稳定、条件温和、对设备损耗小和不会产生酸碱废水污染环境等重要优势,因此微生物酶解法在海藻多糖降解与寡糖制备领域具有重要应用潜力。但是,天然海藻的成分复杂,即便是同种海藻,其中也会含有不同种类的海藻多糖(如红藻中常常同时存在琼胶和卡拉胶)。而现有许多多糖降解菌株的降解能力单一,因此要降解复杂海藻多糖往往需要发酵多个菌株,进而增加了寡糖制备的成本。由此可见,海藻寡糖制备领域亟待开发一种基于单个菌株的复杂海藻多糖降解方法以降低相关的降解成本。本文旨在从海洋环境中分离得到具有复杂海藻多糖降解能力的菌株,并进行基因组分析与活性优化,降低复杂海藻多糖的降解成本,为基于单个菌株的复杂海藻寡糖制备工艺的开发奠定基础。本文研究结果概括如下:(1)复杂多糖降解菌株的分离、培养与鉴定。通过简易2216E培养基,分离得到3株菌株,分别为YPW1、YPW6和WPAGA9。16S r RNA基因序列比对结果表明,YPW1与Microbulbifer mangrovi DD-13具有99.44%的最大相似性,因此将其鉴定为微泡菌属;WPAGA9与Shewanella pacifica KMM3597具有99.87%的最大相似性,因此将其鉴定为希瓦氏菌属;YWP6菌株与Streptomyces sundarbansensis MS1/7具有99.65%的相似性,因此鉴定为放线菌属。其中Microbulbifer sp.YPW1和Shewanella sp.WPAGA9具有多糖降解活性,YPW6有单一一种多糖的降解能力;(2)复杂多糖降解菌株的基因组测序与分析。YPW1的基因组大小为4,578,595bp,平均GC含量为57.64 mol%。该基因组中总共注释了3,680条编码基因、12条r RNA基因和52条t RNA基因。WPAGA9的基因组大小为4,942,986 bp,平均GC含量为40.82mol%,该基因组中共注释了4,127条编码基因、25条r RNA基因和97条t RNA。在YPW1基因组发现7条琼胶酶基因、3条褐藻胶裂解酶基因、3条木聚糖酶基因、1条壳聚糖酶基因、3条淀粉酶基因、3条纤维素酶基因、3条几丁质酶基因、3条果胶酸盐裂解酶基因和2条支链淀粉酶基因。在WPAGA9基因组中发现3条琼胶酶基因、1条褐藻胶裂解酶基因、1条卡拉胶酶基因、2条木聚糖酶基因、4条淀粉酶基因和1条支链淀粉酶基因,8条几丁质酶基因。(3)YPW6基因组大小为7,695,589 bp,GC含量为72.02%。重复序列总长度为179,759 bp,含量为2.34%,注释6,760条编码蛋白基因,平均长度988 bp。另有18条r RNA基因、66条t RNA基因、29条nc RNA基因、1条长度为87 bp的假基因、167条CRISPR基因、19条基因岛基因和4条前噬菌体基因,8条几丁质酶基因。(4)Shewanella sp.WPAGA9的降解活性优化。单因素条件优化结果证明,WPAGA9菌株中琼胶酶、卡拉胶酶和褐藻胶裂解酶反应和生产的最佳条件非常相似,包括最佳温度(50℃),有显著影响作用的金属离子(Na+),碳源(麦芽糖)和碳源浓度(1.5%;w/v),表明WPAGA9降解不同海藻多糖的条件呈现趋同进化。在最佳条件下,WPAGA9对琼脂,褐藻胶和卡拉胶的最大酶活性分别为71.63、76.4和735.13U/m L。与其他菌株相比,WPAGA9对于3种海藻多糖的降解活性均具有一定优势。由此可见,WPAGA9的发酵液可以同时降解复杂海藻多糖并制备得到相应的海藻寡糖,因此极大程度地降低了相关产品的生产成本。总体而言,本研究对分离得到的3株菌株进行了基因组分析,并对其中具有复杂海藻多糖降解能力的Shewanella sp.WPAGA9进行了产酶及酶反应条件的优化。结果证明,该菌株在生产活性海藻寡糖领域有较大的应用前景,该项工作从基因组学和生化角度研究希瓦氏菌属(Shewanella)成员的复杂多糖降解能力,从而加深了对该菌属生态功能的认识,同时也为该菌株的工业价值提供研究基础。
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