论文部分内容阅读
昆虫中肠是一个复杂的环境,不仅是昆虫消化的重要场所,也是昆虫防御细菌等病原物的第一道防线。粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）PS-1,是一类具有高效致病能力的革兰氏阴性菌,通过昆虫口器进入昆虫肠道,可感染甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）等多种农业害虫,但甜菜夜蛾中肠免疫PS-1的分子机制不清楚。为阐述甜菜夜蛾S.exigua中肠对PS-1免疫的分子机制,本研究在测定PS-1对甜菜夜蛾幼虫毒力和影响中肠形态变化的基础上,测定了PS-1侵染后不同时间点的甜菜夜蛾S.exigua中肠的转录组,筛选了甜菜夜蛾S.exigua中肠免疫PS-1的相关差异基因,q RT-PCR检测了相关基因的表达趋势;q RT-PCR结合RNAi筛选并鉴定了甜菜夜蛾S.exigua中肠免疫PS-1的关键效应因子,结果为今后研究甜菜夜蛾中肠免疫病原微生物的分子机制提供了理论基础。主要研究结果如下:为探究粘质沙雷氏菌对甜菜夜蛾S.exigua的侵染效果,本研究对甜菜夜蛾4龄幼虫添食不同浓度的PS-1,统计不同浓度PS-1在不同时间对甜菜夜蛾的致死率。SPSS分析表明,在24 h,48 h,72 h,PS-1对S.exigua的LC50分别为5.7×108、2.3×108、7.6×107CFU/ml。利用1×108 CFU/ml浓度的PS-1侵染S.exigua四龄幼虫,分别解剖侵染后24 h,48 h,72 h中肠,制备石蜡切片,电镜分析发现,PS-1菌株能够破坏甜菜夜蛾幼虫中肠肠壁细胞,使肠壁细胞结构变形,出现不规则的囊状突起,围食膜脱离肠壁细胞,细胞后期不完整甚至脱落,表明PS-1可破坏甜菜夜蛾中肠围食膜,达到继续侵染致死甜菜夜蛾幼虫。为探讨中肠免疫粘质沙雷氏菌PS-1的分子机制,利用1×108 CFU/ml浓度的PS-1侵染S.exigua,分别解剖侵染后1 d、2 d、3 d中肠,以健康甜菜夜蛾为对照,RNA-Seq分别测定其转录组,将获得转录结果分为CK1-1d、CK2-2d和CK3-3d三个对比组进行两两比较,根据限定条件筛选了差异表达基因。CK1-1d对比组上调的差异表达基因数为473个,下调的差异表达基因数为939个;CK2-2d对比组,上调的差异表达基因数为1743个,下调的差异表达基因数为613个;CK3-3d对比组,上调的差异表达基因数为782个,下调的差异表达基因数为1412个,其中免疫相关基因筛选出38个,包括识别受体、信号通路基因,效应因子和其他免疫相关基因,其中抗菌肽基因cecropin A2、moricin、gloverin等都在后期显著上调,DUOX相关基因在前期上调,这些基因都参与到甜菜夜蛾中肠对粘质沙雷氏菌的免疫中。对CK1-1d、CK2-2d、CK3-3d三个处理组的GO功能分析,CK1-1d对比组中得到42个GO条目,其中具有结合和细胞过程的功能基因条目占比最多,CK2-2d对比组中得到43个GO条目,其中具有结合、催化活性、代谢过程功能基因条目占比最多,CK3-3d对比组中得到44个功能亚类,占比最多的条目与以上两个对比组相同。对CK1-1d、CK2-2d、CK3-3d三个处理组pathway富集分析,在CK1-1d对比组中RNA转运和嘌呤代谢的基因数最多。在CK2-2d对比组中甘油磷酸脂酶代谢的基因数最多。在CK3-3d对比组中参与次生代谢产物合成的基因数最多。将转录组和实验室测定的i TRAQ进行关联分析,在PS-1处理第3d的转录组和蛋白质组中发现8个差异的相关基因/蛋白,其中有6个基因（lysozyme、disintegrin、serine protease、serpin、immune-related Hdd11、ROS modulator）显著上调,2个基因（ATP-binding cassette、JNK interaction protein）显著下调,表明上调基因lysozyme等在PS-1侵染后期,具有抑制PS-1侵染的作用。根据转录组筛选的差异表达的相关免疫基因（Unigene）序列设计特异性引物,q RT-PCR验证了其表达趋势,其中识别受体基因（Golgi apparatus protein,PGRP-LB,Scavenger receptor）,信号通路相关基因（Dorsal,spatzle）,效应因子相关基因（Cecropin,Lysozyme,moricin）,DUOX通路相关基因（ROS modulator）在转录组中的表达趋势与q RT-PCR验证结果一致。根据转录组中DUOX通路相关基因和抗菌肽相关基因的Unigene序列设计特异引物,q RT-PCR检测PS-1（1×108 CFU/ml）诱导后其转录表达,结果表明,GPCR,IP3,Imd,P38,DUOX基因在诱导后基因显著上调,PLCβ上调不明显;抗菌肽相关基因均有诱导表达,而且在后期（72 h）显著上调,且Lebocin和Moricin不仅在72 h有高表达,在36 h和48 h时间点也有较高的表达,表明抗菌肽Lebocin和Moricin在PS-1侵染甜菜夜蛾后期起主要作用,而ROS在PS-1侵染前期负主要免疫异物的作用。综上所述,本研究测定了PS-1侵染甜菜夜蛾肠道的转录组,并筛选了甜菜夜蛾中肠免疫PS-1的免疫相关差异基因;q T-PCR技术初步探讨了甜菜夜蛾免疫粘质沙雷氏菌的基因表达情况;证明了DUOX通路相关基因以及抗菌肽参与到中肠免疫反应。结果为阐明甜菜夜蛾中肠动态免疫粘质沙雷氏菌PS-1的分子机制提供了理论基础。