论文部分内容阅读
研究目的：
1.AHI1蛋白和摄食的关系；
2.AHI1蛋白与5-HT2CR之间的关系。
材料与方法：
1.建立食欲增加的动物模型
1.1饥饿动物模型
30只8周龄雄性C57BL/6J小鼠，分三组，分别饥饿48h，24h，0h，期间可自由饮水。处死取下丘脑。Westernblotting和Real—TimePCR检测AHI1的变化。
1.22-DG腹腔注射造成的饥饿模型
20只8周龄雄性C57BL/6J小鼠，分为2组，2-DG组2-DG(250mg/kginsaline，ip)，对照组注射生理盐水；2-DG(2-脱氧—D—葡萄糖)是一种碳水化合物代谢选择性阻断剂，注射后小鼠摄食增加，4个小时内作用明显。监测4个小时的摄食量，处死取下丘脑。Westernblotting和Real—TimePCR检测AHI1的变化。
1.3STZ介导的1型糖尿病模型
0.1mol/l的枸橼酸钠和枸橼酸1∶1，调至PH值4.5，超净台内过滤，配制STZ溶液。20只8周龄雄性C57BL/6J小鼠，分为2组。一组注射STZ溶液(200mg/kgip)，另一组注射枸橼酸钠缓冲液。一周内测2次血糖，均超过16.7mol/l即可以认为造模成功。处死取下丘脑。Westernblotting和Real—TimePCR检测AHI1的变化。
1.42型糖尿病动物模型(db/db小鼠)
购买雄性成年db/db小鼠7只。对照组是性别年龄匹配的C57BL/6J小鼠。取5只做westernblotting，2只做免疫组织化学。观测小鼠下丘脑AHI1蛋白的改变，以及小鼠下丘脑各个核团AHI1蛋白量的改变。
2.降低下丘脑AHI1的表达观察对体重摄食的影响
40只8周龄雄性C57BL/6J小鼠用siRNA沉默下丘脑摄食相关核团VMH等的AHI1表达来改变AHI1的含量，监测一个月小鼠的摄食量、体重改变。
方法：8％水合氯醛100-150mg/kg体重进行动物麻醉，按TheMouseBrain小鼠图谱(2001，1997byACADEMICPRESS)前后-1.1mm，旁开±0.5mm，深度—5.5mm，腺病毒包裹的AHI1特异性shRNA(量1011pfu/ml)，溶于PBS中，每侧注射1μL。用脑立体定位仪及微量进样器注射入双侧下丘脑腹内侧核内，10min注射完，留针2min。对照组注射腺病毒包裹的scramble—shRNA(空载体)。
3.AHI1蛋白和5-HT2cR关系的研究
3.1免疫荧光组织化学和免疫荧光细胞化学检测共定位关系
8周龄雄性C57BL/6J小鼠心脏灌注处死，取脑组织，4％多聚甲醛浸泡充分后固定。固定结束后用30％蔗糖渗透，OCT冰冻包埋，制备8μm厚度的冰冻切片。用PBS摇动清洗切片10min。样品用正常胎牛血清(PBS+10％FBS+0.2％Triton)室温封闭2小时，与适当比例稀释的一抗(抗AHI11:200和抗5-HT2cR1:8)于4℃孵育过夜。次日用磷酸盐缓冲液(PBS+1％BSA+5％Tween)漂洗4次，每次10分钟，然后加适当比例稀释的荧光标记二抗(先敷donkeyantiGoat488，室温孵育1小时，再次充分漂沈。然后敷Goatantirabbit594，室温孵育1小时，再次充分漂洗)。最后用DAPI染色并漂洗后，80％甘油—磷酸盐缓冲液封片。培养小鼠下丘脑神经元至14Div(dayinvitro)，4％PFM—PB室温固定30min，AbAHI11:300andAb5HT2cR1:8共染。步骤如上。在激光共聚焦显微镜下观察两种分子的定位。
3.2免疫共沉淀检测AHI1蛋白和5-HT2cR的相互结合关系
冻干的蛋白A—琼脂糖珠(proteinA—sepharosebeads)在室温下加bufferA溶胀30min或更长时间，切忌用任何搅拌器搅拌，每克干粉可溶到3-4ml水合凝胶。取适量蛋白A—beads用RIPA洗2次，并重悬于RIPA中备用；预冷离心机。取实验老鼠，断头后2min内取完整脑组织。在研磨器里加入RIPAbuffer进行匀浆(或简短超声裂解)。组织匀浆液在16000rpm，4℃，离心15min(S1)。用BCA试剂盒测S1样品浓度，并调节终浓度为1mg/ml。依照每毫克S1蛋白加80μl50％beads量，混合S1和相应的50％蛋白A—sepharosebeads(可使用回收beads)，然后，在4℃孵育1h，以减少非特异性结合。沉淀后，除去beads，然后加入AHI1(Cterminal)抗体到上清液(S2)，4℃反复颠倒混匀，过夜。混合S2和新的50％蛋白A—sepharosebeads，室温孵育2h，沉淀免疫复合物。离心，收集免疫沉淀，并用RIPAbuffer洗3次(选用300mMNaCl作为漂洗溶液)。免疫沉淀物和S2进行westernblotting分析SHT2cR和AHI1蛋白。
4.统计学分析
实验结果的统计分析、灰度分析、数据制图采用molecularDynamics，Graphadsoftware，SPSS11.0。实验数据符合正态分布者用平均值±标准差(n=有效样本例数)表示。首先对每组数据进行正态性、方差齐性检验然后采用随机化配对资料均数的t检验，经正态性检验三组数据采用单因素方差分析，P<0.05认为差异显著(*)，P<0.01认为差异较显著(**)。
实验结果：
1.食欲增加模型
1.1饥饿动物模型
饥饿组和正常组小鼠相比，westernblotting显示AHI1蛋白在饥饿后增加(对照组VS饥饿24h组P<0.05：对照组VS饥饿48h组P<0.05；饥饿24h组VS饥饿48h组P>0.05)。Real—TimePCR显示饥饿后AHI1mRNA增加约50％和80％。
1.22-DG腹腔注射造成的饥饿模型
2-DG注射4h内药物组小鼠比对照组小鼠摄食增加(P<0.05)，westernblotting显示AHI1蛋白增加(P<0.01)，Real—TimePCR显示下丘脑的AHI1mRNA增加约87％。
1.3STZ介导的1型糖尿病模型
正常小鼠组与STZ造成的1型糖尿病小鼠组比较westernblotting显示AHI1蛋白增加(P<0.01)，Real—TimePCR显示AHI1mRNA增加约60％。
1.42型糖尿病动物模型(db/db小鼠)
免疫组织化学和westenblotting显示db/db小鼠组与正常小鼠组比较下丘脑的AHI1蛋白增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
2.降低下丘脑AHI1的表达观察对体重摄食的影响
应用RNA干扰降低小鼠下丘脑AHI1的表达后，小鼠在RNA干扰后的两周内摄食下降明显(D4，D9-D13P<0.05；D5-D8P<0.01；D1-D3，D14-D30P>0.05)，体重也有明显下降(D3，D9-D12P<0.05；D4-D8P<0.01；D1-D2，D13-D30P>0.05)。
3.AHI1蛋白和5-HT2cR的共定位和相互结合关系研究
3.1小鼠下丘脑神经元以及下丘脑组织免疫组织化学荧光结果
完整的神经元中AHI1蛋白和5HT2cR主要分布在胞体核周区，突触内有少量分布(特别是在突触分支处)。神经元胞体内AHI1蛋白成“stigmoidbody”状分布，5HT2cR的分布与这些stigmoidbodies有部分重叠。可见散点状共染。
小鼠脑组织免疫组织化学荧光显示：ARC、LH、VMH内均可看到AHI1蛋白和SHT2cR散点状共染。
3.2免疫共沉淀检测AHI1蛋白和5-HT2cR的相互结合关系
免疫共沉淀显示小鼠下丘脑组织中AHI1蛋白和SHT2cR存在相互结合关系。
结论：
1.AHI1蛋白可促进摄食。
2.AHI1蛋白和5-HT2cR可相互结合。