复杂生物样品中与疾病相关生物分子的灵敏、快速、准确检测对于研究疾病的发生发展、疾病诊断与治疗等具有十分重要的意义。但由于在疾病的发生发展初期，相关生物分子在组织或血液中表达很低，利用常规方法无法检测到，难以实现疾病的早期诊断，因此发展生物分析新原理新方法，实现生物检测的信号放大并有效提高检测灵敏度，是目前生物分析化学领域的热门课题。本论文围绕生物分子检测的信号放大方法需求，基于表面原子转移自由基聚合和纳米探针，开展了以下三个方面的工作:　　 1、表面原子转移自由基聚合反应基础及其生物传感应用　　 将引发剂分子通过共价键合的方式与DNA或蛋白质分子偶连，研究固体表面生物分子存在时原子转移自由基聚合反应原理及基础条件。进一步利用DNA杂交或夹心免疫反应将标记有引发基团的生物分子固定到电极或基质表面，选择具有侧链功能基团的单体进行原子转移自由基聚合反应。该聚合反应由引发基团数量（固定的标记生物分子数量）及其外部条件（催化剂、单体量、温度、溶剂等）控制，当引发基团数量（生物分子浓度）确定时，聚合物的生长使成百上千个单体分子聚集形成长链聚合物，由于聚合物的侧链带有功能基团且能与电化学或光学活性物质发生键合反应，从而显著增加了单元生物分子识别反应的信号分子负载量，实现了生物分子检测的信号放大，提高了检测灵敏度。　　 基于这种表面原子转移自由基聚合反应辅助的信号放大方法，成功地构建了四种生物传感器:　　 (1) DNA/卵清蛋白(ovalbumin)电化学传感器。利用DNA杂交或分子特异性识别将标记有引发基团的DNA检测探针或ovalbumin固定到电极或金片表面，选择具有活性羟基的甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)或具有环氧基的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)单体进行原子转移自由基聚合反应。椭圆偏振计数据表明，金片上形成的聚合物的厚度大约为20 nm。形成的长链聚合物的侧链带有羟基或环氧基能与电化学活性物质氨基二茂铁(FcNH2)发生键合反应，键合在聚合物链上的二茂铁衍生物具有灵敏的电化学响应，可用于溶液中DNA/ovalbumin的测定。最优实验条件下，DNA浓度的对数在浓度为0.1～1000 nM范围内与电化学信号呈良好的线性关系，其检测限为15 pM; ovalbumin浓度的对数在浓度为在0.1～500ng mL-1范围内与电化学信号呈良好的线性关系，其检测限为0.07 ng mL-1。　　 (2)前列腺抗原(PSA)/癌胚抗原(CEA)电化学传感器。利用夹心免疫反应将标记有引发基团的PSA或CEA固定到电极或金片表面，以GMA为单体进行原子转移自由基聚合反应。通过形成的长链聚合物侧链上环氧基嫁接FcNH2，制得灵敏的PSA/CEA电化学传感器。最优实验条件下，PSA和CEA浓度的对数分别在浓度为0.001～40 ng mL-1及0.0005～40 ng mL-1范围内与电化学信号呈良好的线性关系，其检测限分别为0.14 pg mL-1和0.10 pg mL-1。制得的传感器分别对60个PSA和40个CEA临床血样进行了检测，所得结果与临床电致化学发光方法得到的结果一致。　　 (3) PSA电化学和流动注射化学发光免疫传感器。利用夹心免疫反应将标记有引发基团的PSA固定到电极或金片表面，以GMA为单体进行原子转移自由基聚合反应。利用长链聚合物侧链上丰富的环氧基团与具有电化学和化学发光活性的辣根过氧化物酶(HRP)分子中的活性氨基之间的化学反应，将HRP偶联在聚合物表面，制得PSA免疫传感器。最优条件下，PSA在浓度为0.0005～20 ng mL-1范围内分别与电化学信号及流动注射化学发光信号呈良好的线性关系，其检测限分别为1.3 pg mL-1和4.0 pg mL-1。电化学信号和流动注射化学发光信号较传统的用HRP标记的抗体作为信号分子的检测信号分别放大了14和13倍。　　 (4) CEA电致化学发光(ECL)传感器。利用夹心免疫反应将标记有引发基团的CEA固定在电极或金片表面，选择具有环氧基的GMA单体进行原子转移自由基聚合反应，并将具有ECL活性的N,N-二异丙基乙二胺(DPEA)偶联在形成的聚合物的侧链上，制得CEA电致化学发光传感器。最优实验条件下，CEA在浓度为0.001～1000 ng mL-1范围内与ECL信号呈良好的线性关系，其检测限为0.5 pg mL-1。　　 基于表面原子转移自由基聚合反应辅助的信号放大方法构建的生物传感器具有灵敏度高、选择性强、检测范围宽等优点，可用于检测低浓度的DNA和蛋白质，为肿瘤疾病的早期诊断与治疗提供了新途径。　　 2、基于纳米生物探针的信号放大方法及其在生物传感中的应用　　 将信号分子负载在二氧化硅(SiO2)纳米粒子表面或包裹在SiO2纳米粒子内部，并进一步在其外表面嫁接对生物分子具有选择性的识别元素，制得纳米探针。由于SiO2纳米粒子可负载更多的信号分子，从而显著增加单元生物分子识别反应的信号分子负载量，提高了检测灵敏度。基于此思路，制得了两种生物传感器:　　 (1)甲胎蛋白(AFP)免疫传感器。首先用种子生长法制得颗粒分散均匀，直径为100±3 nm的SiO2纳米粒子。然后将SiO2纳米粒子表面用γ-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPMS)进行硅烷化处理，并一步将HRP和AFP二抗以一定比例共同固定在其表面，制得AFP纳米生物探针。最后利用夹心免疫反应将AFP纳米生物探针捕获到电极或金片表面，构建了灵敏的AFP免疫传感器。最优实验条件下，AFP在浓度为0.05～3 ng mL-1范围内与电化学信号呈良好的线性关系，其检测限为0.01 ng mL-1; AFP在浓度为0.01～3 ng mL-1范围内与流动注射化学发光信号呈良好的线性关系，其检测限为0.01 ng mL-1。电化学信号和流动注射化学发光信号较传统的用HRP标记的抗体作为信号分子的检测信号分别放大了29.5和61倍。　　 (2)凋亡肝癌细胞（HepG2）ECL传感器。首先用反相微乳法合成了包裹有Ru(bpy)32+的尺寸规整、直径大约为50 nm的SiO2纳米小球。然后将磷酯酰丝氨酸抗体(APSA)固定在经硅烷化处理后的SiO2纳米粒子表面，制得纳米探针。利用纳米探针表面的APSA与修饰在电极上的凋亡HepG2细胞表面上的磷酯酰丝氨酸抗原(PS)之间的免疫反应将上述纳米生物探针固定在电极表面，制得灵敏的凋亡HepG2细胞ECL传感器。最优实验条件下，细胞数的对数在800～1.0×107 cells mL-1与ECL信号呈良好的线性关系，并借助于荧光光谱和荧光显微镜，评估了抗肿瘤药物与细胞的相互作用，监控了肿瘤细胞表面抗原的动态变化，并检测了细胞的异质性。　　 基于纳米探针的信号放大方法制备的生物传感器操作简单、价廉、特异性强，为临床肿瘤标志物的灵敏检测、药物筛选和个体用药提供了新方法。　　 3、硼酸修饰纳米填充柱的制备及其生物传感应用　　 在琼脂糖凝胶或玻璃微球表面嫁接硼酸基团，并填充在毛细管中作为硼酸免疫分析柱，利用硼酸基团对糖类抗原的点位识别作用，建立了血液中糖类抗原的流动注射化学发光(CL)免疫检测方法。　　 (1)玻璃微球为载体的硼酸免疫分析柱。首先将玻璃微球硅烷化，使其表面形成环氧硅烷单层，并进一步与氨基苯硼酸(APBA)上的氨基之间发生开环化学反应，将APBA修饰到玻璃球表面并填充在玻璃管中，利用硼酸基团对糖类抗原AFP的识别作用，将AFP抗原固定在分析柱中，制得硼酸免疫分析柱。然后通过免疫反应，将分析物AFP和辣根过氧化物酶标记的AFP抗体(HRP-anti-AFP)的混合物中游离的HRP-anti-AFP捕获到分析柱中。最优实验条件下，AFP浓度在10～100 ng mL-1范围内与CL信号呈良好的线性关系，相关系数是0.993。　　 (2)琼脂糖凝胶为载体的硼酸免疫分析柱。将硼酸琼脂糖凝胶填充在玻璃管中，利用硼酸基团对糖类抗原AFP的识别作用，将AFP固定到分析柱中，制备成硼酸免疫分析柱。然后通过免疫反应，将温育溶液中游离的HRP-anti-AFP捕获到分析柱中。用紫外分光光度计对捕获的HRP-anti-AFP的活性进行了检测。最优实验条件下，AFP浓度在5～120 ng mL-1和300～1000 ng mL-1范围内与CL信号呈良好的线性关系，相关系数分别是0.9987和0.9998。　　 该方法克服了传统的免疫传感器只能用一次及制备重复性差的缺点，为研究糖化蛋白质与氨基苯硼酸的作用机理、糖化蛋白质的分离及浓度的测定、药物的传递与释放提供了新方法。