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研究背景:缺氧（hypoxia）是人类许多疾病中常见的病理生理过程。缺氧时,缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）可通过调控低氧反应元件及其靶基因促使细胞适应缺氧环境。作为HIF-1α靶基因的内皮素-1（endothelin-1,ET-1）是广泛存在于心血管系统的肽类激素,具有多种生物学效应,如收缩血管、促进细胞有丝分裂、刺激神经肽和心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide,ANP）释放等。ANP作为调节心血管稳态的肽类激素,主要由心房肌细胞合成和分泌,具有抵抗ET-1、炎症、肥大、纤维化及心肌缺血/再灌注损伤等作用。缺氧时ANP的分泌明显增加从而促使细胞适应缺氧环境,保护心脏免受缺氧性损伤,减缓心衰的发展,防止扩张型心肌病的病理重塑。因此,阐明缺氧诱导ANP的分泌机制并调控其水平有望成为预防和治疗相关疾病的有效策略。本研究前期工作已发现缺氧时内源性ET-1通过其A和B型受体（ET receptor type A and B,ETRA＆ETRB）上调烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX）4 的表达,并活化Src酪氨酸蛋白激酶（Src tyrosine kinase,Src）从而调控心房ANP分泌。有研究表明,ET-1可引起氧化应激并增加白介素18（interleukin,IL-18）的释放,从而介导炎症反应。IL-18作为一种促炎细胞因子可通过磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide-3-kinase,PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B,Akt）激活GATA结合蛋白4（GATA binding protein 4,GATA4）,进而促进心肌细胞ANP的转录及合成。另外,ET-1还可通过环氧合酶2（cyclooxygenase 2,COX2）促使花生四烯酸代谢而生成前列腺素（prostaglandin,PG）H2;载脂蛋白型前列腺素 D 合酶（lipocalin-type prostaglandin D synthase,L-PGDS）则是将 PGH2 转变为PGD2的COX2下游生物合酶,具有抗炎和保护缺血/缺氧心脏等作用。然而,在缺氧时内源性ET-1对IL-18和COX2及其下游L-PGDS的作用以及与心房ANP分泌的相互关系尚不清楚。目的:本研究分别在离体搏动大鼠心房,体外培养的HL-1心房肌细胞及大鼠在体心房建立缺氧模型,观察内源性ET-1对IL-18和COX2及L-PGDS表达的影响,探讨其对ANP表达和分泌的作用机制,为阐明缺氧时ANP分泌的机理和临床利用提供必要的理论和实验依据。实验方法:1.缺氧模型的制备:（1）取SD大鼠的左心房挂置于离体搏动大鼠心房灌流装置,并采用N2替代O2的方法建立离体搏动大鼠心房缺氧模型;（2）使用三气细胞培养箱（1%O2,94%N2,5%CO2）构建HL-1心房肌细胞缺氧模型;（3）将SD大鼠置于常压缺氧舱,设置气体环境为10%O2,90%N2以制备在体大鼠缺氧模型。2.利用多道生理信号采集系统连接压力感受器观察并记录心房搏动压。3.利用实时定量 PCR（quantitative real-time PCR,q-PCR）检测 ANP、ET-1、IL-18、活化转录因子 3（activating transcription factor 3,ATF3）、淋巴增强因子1（lymphoid enhancer factor,LEF1）和COX2 的 mRNA 水平。4.采用放射免疫分析检测ANP和ET-1的含量。5.利用蛋白质印迹法（western blot,WB）分别检测IL-18及其受体亚基、ETRA、ETRB、NOX2、NOX4、Src、G蛋白Rho家族选择性鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factors selective for the Rho family of G-proteins,RhoGEF;p115RhoGEF）、RhoA、ATF3、T 细胞因子（T cell factor,TCF）3、TCF4、LEF1、HIF-1α、COX2、L-PGDS、核因子红细胞 2 相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2）和过氧化物酶体增生物激活受体γ（peroxisome proliferator-activate receptor γ,PPARγ）表达。6.利用过氧化氢（H2O2）测试盒检测H2O2水平。7.使用酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测IL-18、PGD2含量。8.选用CCK-8试剂盒检测HL-1细胞活性。9.采用活性氧（reactive oxygen species,ROS）荧光探针（DCFH-DA）检测细胞内ROS水平。10.通过 Lipofectamine 2000 分别向 HL-1 细胞转染IL-18-siRNA、ATF3-siRNA、LEF1-siRNA 和 COX2-siRNA,以干扰 HL-1 细胞 IL-18、ATF3、LEF1及COX2表达。11.利用免疫荧光染色（immunofluorescence,IF）观察IL-18和COX2表达情况。12.利用血气分析仪观察氧分压（oxygen pressure,pO2）变化。13.采用苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）和Masson染色观察心房病理改变。实验结果:第一部分:ET-1-IL-18信号通路对缺氧心房ANP分泌的影响1.IL-18参与缺氧诱导离体搏动大鼠心房ANP分泌:（1）缺氧明显增加ANP的mRNA水平、表达和分泌,并伴随心房搏动压显著下降。（2）缺氧同样明显促进IL-18的表达与分泌,且显著上调其受体α和β亚基（IL-18 receptor αand β subunit,IL-18Rα and IL-18Rβ）的表达;而 IL-18 的阻断剂 IL-18 结合蛋白（IL-18 binding protein,IL-18BP）明显减缓缺氧增加心房ANP的mRNA水平、表达与分泌作用。2.内源性ET-1调控离体搏动大鼠缺氧心房IL-18表达的信号路径分析:（1）缺氧明显增加离体搏动大鼠心房ET-1含量,并上调其两种受体ETRA和ETRB表达。ETRA和ETRB选择性拮抗剂BQ123和BQ788可基本阻断缺氧上调IL-18及其受体表达的作用。（2）缺氧条件下NOX4的表达、H2O2的生成及Src的表达均显著增加,BQ123及BQ788可完全阻断缺氧上调NOX4及Src表达的作用。（3）NOX4的阻断剂GLX351322（GLX）也可完全废除缺氧增加H2O2的生成和Src表达的效应。（4）ROS的清除剂Nacetyl cysteine（NAC）减缓缺氧上调Src表达的作用与GLX效果类似。（5）Src的抑制剂Src inhibitor 1（SrcI）通过抑制RhoGEF和RhoA完全阻断缺氧对IL-18及其受体作用,同时显著减缓缺氧增加ANP分泌的效应。3.ET-1-IL-18调控离体搏动大鼠缺氧心房ANP分泌的信号路径分析:缺氧显著上调离体搏动大鼠心房肌ATF3和TCF3、TCF4以及LEF1的表达,该作用可被BQ123、BQ788和IL-18BP完全阻断,并伴随缺氧诱导ANP分泌的显著减缓。4.ET-1-IL-18对缺氧HL-1心房肌细胞ANP表达的作用:（1）缺氧明显增加HL-1细胞ET-1和ANP的mRNA水平与表达,并显著增加ETRA和ETRB表达。（2）缺氧明显上调HL-1细胞NOX4、IL-18、ATF3及LEF1的表达,这些作用均可被BQ123和BQ788基本阻断。（3）利用IL-18-siRNA干扰HL-1细胞IL-18表达可明显抑制缺氧增加ATF3和LEF1表达的作用,并伴随ANP表达的降低。（4）ATF3-siRNA干扰HL-1细胞ATF3可完全阻断缺氧上调LEF1的表达,而LEF1-siRNA干扰LEF1后则显著抑制缺氧增加ANP的mRNA水平与表达的效应。5.ET-1-IL-18对缺氧大鼠在体心房ANP表达的作用:在缺氧大鼠在体心房,内源性ET-1也可通过IL-18调控ANP的mRNA水平与表达（与离体搏动心房以及HL-1心房肌细胞的实验结果基本一致）。第二部分:ET-1-COX2信号通路对缺氧心房ANP分泌的影响1.ET-1-COX2调控离体搏动大鼠缺氧心房ANP分泌的信号路径分析:（1）缺氧显著上调离体搏动大鼠心房COX2和L-PGDS的表达,并增加PGD2的生成和PPARγ的磷酸化,该作用被BQ123和BQ788完全阻断。（2）COX2的抑制剂Celecoxib（Cele）也完全抑制缺氧上调的L-PGDS、PGD2及p-PPARγ的表达;而PPARγ的抑制剂GW9662可明显减缓缺氧诱导ANP分泌的作用,其效应与ET受体、COX2和PGD2及PGF2α受体拮抗剂（AH6809和AL8810）抑制缺氧诱导ANP分泌的作用类似。（3）PGD2还可通过激活Nrf2正反馈调节L-PGDS的表达。2.ET-1调控的IL-18和COX2信号通路间的串扰:在离体搏动大鼠缺氧心房,COX2、L-PGDS、PPARγ以及ANP受体选择性拮抗剂A71915可进一步增强缺氧诱导IL-18及其受体表达的作用;而IL-18BP可基本解除缺氧上调的COX2、L-PGDS和PPARγ表达的作用。3.ET-1-COX2对缺氧HL-1心房肌细胞ANP表达的作用:利用COX2-siRNA干扰HL-1细胞COX2表达可明显抑制缺氧上调L-PGDS及其下游p-PPARγ表达的作用,同时伴随ANP表达的减少。这些效应与COX2对离体搏动大鼠缺氧心房ANP表达与分泌的作用极其类似。4.ET-1-COX2对缺氧大鼠在体心房ANP表达的作用:（1）在缺氧大鼠在体心房,COX2也可通过L-PGDS及其下游PPARγ调控ANP的mRNA与表达作用。这些效应与离体搏动大鼠缺氧心房及HL-1细胞所观察的结果类似。（2）缺氧导致心房肌细胞排列紊乱,细胞间质炎性细胞浸润和胶原纤维沉积;IL-18BP可明显改善缺氧诱导心房病理性改变的作用,但Cele和A71915则相反。结论:1.内源性ET-1通过NOX4参与调控缺氧心房IL-18的生成;2.NOX4-IL-18信号途径可通过ATF3-TCF3/TCF4-LEF1介导内源性ET-1调节缺氧心房ANP的表达与分泌;3.COX2通过L-PGDS及其下游PPARγ介导内源性ET-1调节缺氧心房ANP的表达与分泌;4.缺氧时L-PGDS衍生的PGD2通过Nrf2正反馈调控L-PGDS表达也是内源性ET-1调节心房ANP分泌的作用机制之一;5.缺氧时IL-18及COX2-L-PGDS-PPARγ通路的串扰也可影响内源性ET-1调节心房ANP分泌的过程;6.缺氧时ANP对IL-18诱导心房纤维化发挥重要的抵制作用。