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目的肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,近年来随着分子生物学等基础研究向肝癌领域的渗透,许多学者开始从分子水平上研究肝癌的发生与发展,其中一些原癌基因的异常高表达得到了广泛的关注。由此把基因治疗和生物治疗引入到肝癌治疗中,RNAi (RNA interference)技术就是研究得比较广泛的一种。本课题选择针对肝癌靶基因Pim-3进行研究,是因为目前关于它的研究主要集中在造血系统及消化系统的一些肿瘤,但有关Pim-3和肝癌的关系报道并不多。另一方面,在肿瘤的发生过程中,肿瘤细胞可以通过许多机制,比如增加IL-10或者TGF-β等免疫抑制性细胞因子的产生、促进调节性T细胞的活化以及增殖等来抑制机体免疫应答,从而使自身逃逸免疫系统的监视,促进肿瘤的发生和转移。因此对于肿瘤的治疗,通过一些免疫刺激剂比如某些RNA序列,来激活机体某些固有的模式识别受体,有望通过激活天然免疫应答,来重新唤醒机体的整个免疫系统,进而引起机体本身对于肝癌细胞的主动杀伤和清除。基于上述背景,我们设计并构建这样一种双功能载体：既能够表达靶向沉默Pim-3基因的shRNA,又能够表达激活TLR受体的单链RNA。在体外观察双功能载体对Pim-3-的沉默作用和对肝癌细胞系凋亡、增殖等细胞生物学特性的影响,及其对于免疫系统的活化情况；同时以Hepa1-6细胞对C57BL/6小鼠进行皮下荷瘤,在肿瘤形成后,瘤内注射这种双功能的表达载体,观察其对于肿瘤的治疗情况以及脾脏淋巴细胞的活化情况。方法1.以小鼠的肝癌细胞系Hepa1-6为主要研究对象,首先通过RT-PCR和Western-blot检测Pim-3在两种小鼠肝癌细胞系Hepa1-6和H22以及正常的小鼠胚胎肝细胞BNL.CL2中的表达。2.用双功能载体转染肝癌细胞系Hepa1-6,通过PCR和Western-blot等方法检测载体对Pim-3表达的沉默效果；检测Hepa1-6细胞中TLR信号通路的活化情况,主要检测I型干扰素的分泌,以确定双功能载体是否构建成功。3.用双功能载体转染Hepa1-624h后,利用流式细胞仪,通过Annexin V/PI染色和TUNEL免疫荧光技术检测肝癌细胞凋亡的变化。4.用双功能载体转染Hepa1-624h后,通过Western-blot等方法检测Bad、p-Bad、 BCL-2、BCL-XL等凋亡相关分子的表达以及凋亡信号通路中caspase-8的活化水平。5.用Hepa1-6对C57BL/6小鼠进行皮下荷瘤,观察瘤内注射双功能载体后,小鼠肿瘤的生长情况,以及脾脏不同淋巴细胞的比例和活化情况。6.进一步研究双功能载体治疗后,脾脏中NK细胞对Hepa1-6的杀伤情况、NK细胞NK受体的表达情况、CD4+T细胞PD-1表达以及外周血TH1和TH2类细胞因子的分泌情况。7.用Hepa1-6对C57BL/6小鼠进行皮下荷瘤,通过清除抗体分别对NK和CD4+T细胞进行清除,观察在双功能载体介导的抗肿瘤作用中,这两种细胞所起的作用。8.体外观察双功能载体作用于Hepa1-6细胞后TLR7的表达情况和NF-κB信号通路的活化情况；通过TLR特异性功能抑制实验来确定TLR7在双功能载体介导的肿瘤治疗中所发挥的作用。结果1.Pim-3在正常小鼠肝组织和正常肝细胞中表达极低,而在肝癌细胞系中明显高表达。2.成功构建既能沉默原癌基因Pim-3又能表达具有免疫刺激作用的ssRNA-shRNA双功能载体。3.用双功能载体转染Hepa1-6细胞后,Hepal-6细胞中的Pim-3在蛋白水平和基因水平上的表达均有明显的下调,细胞凋亡明显增加,凋亡相关分子p-Bad、 BCL-2、BCL-x1的表达明显下调,caspase-8的分泌明显增加。4.用Hepa1-6细胞对C57BL/6小鼠进行皮下荷瘤2周,随后瘤内注射双功能载体进行治疗,发现双功能载体可以显著抑制肿瘤的生长,同时增加脾脏淋巴细胞中NK细胞和CD4+T细胞的比例,并且诱导NK细胞和CD4+T细胞的活化。5.进一步分析脾脏NK细胞的杀伤活性发现,在用双功能载体治疗后的小鼠中,NK细胞表现出最强的杀伤活性,同时NK细胞NKG2D表达增强,NKG2A表达降低；IFN-γ表达增强,PD-1的表达降低,而CD4+T细胞所表达的PD-1也明显降低,外周血中THl细胞因子表达增加,而TH2细胞因子的表达减少。6.用Hepa1-6对C57BL/6和小鼠进行皮下荷瘤,肿瘤形成后,通过特异性抗体分别对NK或者CD4+T细胞进行清除,发现清除NK细胞后双功能载体的抗肿瘤作用明显削弱。7.CD4+T细胞的存在对于维持NK细胞的活化起着重要的作用,在清除CD4+T细胞后,NK细胞的活化明显减弱。8.在体外用双功能载体转染Hepa1-6细胞后,TLR7表达明显上调,NF-κB的磷酸化水平升高；通过抑制剂阻断小鼠体内的TLR7后,双功能载体的抗肿瘤活性减弱,NK和CD4+T细胞的活化都受到了影响。结论1.成功构建了能够特异性沉默Pirn-3和表达免疫刺激性ssRNA的双功能载体。2.双功能表达载体能显著抑制肝癌细胞中Pim-3的内源性表达,进而明显诱导肝癌细胞系Hepa1-6细胞的凋亡,并能诱导Ⅰ型干扰素的基因表达和蛋白分泌。3.双功能载体能抑制肝癌皮下荷瘤小鼠中肿瘤的生长,并能引起脾脏和肿瘤原位淋巴细胞NK和CD4+T细胞的活化。4.在双功能载体介导的肿瘤治疗作用中,NK细胞的功能是必不可少的。双功能载体能增强NK细胞活化性受体NKG2D的表达,下调抑制性受体NKG2A的表达,且增强肿瘤细胞表面NKG2D配体的表达,从而提高NK细胞对肿瘤细胞的直接杀伤活性。5.双功能载体能明显诱导CD4+T细胞的活化,而且CD4+T细胞主要对NK细胞的活化起着辅助作用。6.在双功能载体介导的肿瘤治疗过程中,TLR7对ssRNA的识别及其信号通路的活化是上述淋巴细胞活化的先决条件,也是治疗效果的保证。7.双功能载体在体外能直接诱导DC细胞CD86的表达和促炎因子的分泌,推测该双功能载体可能通过活化DC等辅助细胞,促进NK和T细胞的活化。