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目的:初步探讨人大肠癌Lovo细胞株聚(腺苷二磷酸核糖)水解酶[poly-(ADP-ribose)glycohydrolase,PARG]基因沉默对HUVEC血管形成能力的影响和可能机制。
方法:采用PARG-shRNA慢病毒载体转染Lovo细胞,并筛选出稳定沉默PARG基因的Lovo细胞株,以未作处理Lovo细胞作为空白对照组,转染慢病毒空载体Lovo细胞作为空载体对照组,转染PARG-shRNA慢病毒载体Lovo细胞作为实验组。ReverseTranscriptase-PCR和Real Time-PCR检测各组细胞PARG mRNA表达变化,Western Blotting检测PARG、聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶[poly-(ADP-ribose)polymerases,PnRP]、p38、磷酸化p38(p-p38)、ERK、磷酸化ERK(p-ERK)、NF-κB、p-IκBα、VEGF、b-FGF、ICAM-1和MMP-9蛋白表达变化。Transwell细胞迁移实验检测Lovo细胞PARG基因沉默对HUVEC迁移能力的影响。收集各组Lovo细胞培养上清液,分别加入到培养液培养HUVEC,并采用CCK-8细胞增殖实验检测HUVEC增殖能力。为进一步探讨p38与ERK细胞信号通路同NF-κB调节系统在人大肠癌细胞中的相互关系,采用ERK抑制剂U0126和p38抑制剂SB203580分别处理Lovo细胞,Westem Blotting分别检测NF-κB和p-IκBα的表达变化;用NF-κB抑制剂PDTC处理Lovo细胞,Western Blotting检测用药后PARP表达、ERK和p38的表达及磷酸化的变化。
结果:1.RT-PCR和Western Blotting均显示实验组PARG表达较对照组显著降低,与对照组比较有明显差异(P＜0.05),表明Lovo细胞株PARG基因沉默;
2.迁移实验结果显示实验组HUVEC迁移穿过微孔膜的细胞数量较对照组明显减少(P＜0.05),其迁移抑制率为55.23％;增殖实验结果显示实验组HUVEC增殖数量较对照组明显减少(P＜0.05),并且随着Lovo细胞培养上清液浓度的降低,其增殖抑制率也降低;
3.Western Blotting提示实验组PARP、p38、p-p38、ERK、p-ERK、NF-κB、p-IκBα、VEGF、b-FGF、ICAM-1和MMP-9表达均明显低于对照组(P＜0.05);
4.分别应用ERK抑制剂U0126和p38抑制剂SB203580后NF-κB和p-IκBα表达明显降低,与空白对照组比较,差异有显著性(P＜0.05);应用NF-κB抑制剂PDTC后PARP表达明显低于空白对照组(P＜0.05),而p38和ERK的表达及磷酸化无改变。
结论:1.沉默Lovo细胞PARG基因可以显著抑制HUVEC的迁移能力;也可以显著抑制HUVEC的增殖能力,并且增殖抑制率随着各组Lovo细胞培养上清液浓度的降低而降低,PARG在人大肠癌促血管形成中可能发挥重要作用:
2.Lovo细胞PARG基因沉默可以同步降低细胞内PARP、p38、p-p38、ERK、p-ERK、NF-κB出和p-IκBα的表达,提示PARG基因沉默降低人大肠癌细胞促血管形成能力可能与p38、ERK和NF-κB通路有关;Lovo细胞中p38和ERK信号转导通路受抑制后,NF-κB活性降低,表明p38和ERK信号转导通路可以调节NF-κB的活性。
3.Lovo细胞PARG基因沉默,同时可以降低VEGF、b-FGF、ICAM-1和MMP-9的表达,提示在人大肠癌中,PARG沉默通过抑制PARP的活性,减少p38和ERK信号转导通路的磷酸化,从而下调NF-κB的活性及其依赖性血管形成因子VEGF、b-FGF、ICAM-1和MMP-9等的表达,在实现降低Lovo细胞促血管形成能力中具有一定作用。