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沙门氏菌和金黄色葡萄球菌是我国农产品质量安全控制的必检项目,建立农产品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的快速检测方法已成为保证农产品质量安全的重要措施。在农产品加工过程中,致病菌会受到各种加工条件的影响(温度、化学物质等),使其处于亚致死状态,易产生假阴性结果,造成漏检。针对我国农产品加工中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测需求,对农产品加工环节中存在的亚致死状态的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行修复培养,利用分子生物学技术,在同一体系内建立两种目标致病菌的快速检测方法,满足实际检测的需要。本研究针对整个检测过程的各个环节进行优化提速,以期达到快速有效的检测目的。相关的研究内容及试验结果如下:1.沙门氏菌和金黄色葡萄球菌共增菌-修复培养基的研制研究农产品加工中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的共增菌-修复培养基,确定共增菌-修复培养基的配方:胰蛋白胨10g,酵母浸粉5g,大豆蛋白胨25g,氯化钠10g,葡萄糖4g,水杨酸2g,丙酮酸钠2g,牛胆盐0.3g,亚碲酸钾0.3mg,氯化锂0.5g,吐温-80 1mL,蒸馏水1000mL,pH7.2±0.2。建立沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的受损模型,通过热应激、冷胁迫和酸损伤的方法使沙门氏菌和金黄色葡萄球菌处于亚致死状态。在3种损伤情况中,沙门氏菌和金黄色葡萄球菌在-80℃冷冻30d亚致死率最高,分别为19.35%和17.26%。对亚致死状态的致病菌进行恢复培养,当选择性培养基和非选择性培养基中菌落计数基本相同时,表示亚致死状态的致病菌以达到完全修复,所用时间即为修复时间。热损伤的沙门氏菌修复时间为2h,热损伤的金黄色葡萄球菌和冷胁迫及酸损伤下的两种目标菌修复时间均为4h。对共增菌-修复培养基进行增菌效果验证。单增菌4h后,沙门氏菌和金黄色葡萄球菌菌液浓度分别为2.2×103CFU/mL和3.7×103CFU/mL,达到多重PCR检出限。复合增菌效果验证结果表明当沙门氏菌和金黄色葡萄球菌以1:1(10CFU/mL)的比例共同培养4h后菌液浓度为6.25×104CFU/mL和4.23×104CFU/mL;沙门氏菌和金黄色葡萄球菌以1:10(10±1CFU/mL:100±10CFU/mL)比例培养4h后菌液浓度为2.1×104CFU/mL和1.9×106CFU/mL;沙门氏菌和金黄色葡萄球菌以10:1(100±10CFU/mL:10±1CFU/mL)比例共同培养4h后菌液浓度为1.02×106CFU/mL和1.4×104CFU/mL;当培养比例为1:100(10±1CFU/mL:1000±100CFU/mL)时,培养6h后低浓度的目标菌能达到多重PCR的检出限,沙门氏菌和金黄色葡萄球菌作为低浓度目标菌时,菌液浓度分别为2.45×103CFU/mL和1.5×103CFU/mL。通过培养基增菌效果验证,无论是单菌增菌培养还是复合增菌培养,培养4-6h满足多重PCR检出限,同时共增菌-修复培养基抑制非目标菌的生长。人工污染食品样品,培养后发现,与纯菌液培养4h达到多重PCR检出限相比,需要直接对人工污染食品样品进行目标菌增菌培养6h,6h后菌液浓度达到104-105CFU/mL,达到多重PCR检出限,无需对农产品基质进行特殊处理,可直接检测。2.沙门氏菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法的研究采用水煮法、试剂盒法、改良CTAB法、DNA提取液法和TEX裂解液法提取沙门氏菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA,比较提取的基因组DNA质量。TEX裂解液法提取的DNA纯度高,操作简单,省时省力,成本低。提取的沙门氏菌基因组DNA纯度为1.88,浓度为412.6ng/μL;金黄色葡萄球菌DNA纯度为1.84,浓度为366.7ng/μL。以TEX裂解液法提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增,电泳检测扩增产物有清晰的目的条带。3.沙门氏菌和金黄色葡萄球菌多重PCR检测体系的建立和优化筛选引物、建立和优化沙门氏菌和金黄色葡萄球菌多重PCR检测体系。选择沙门氏菌invA基因为靶基因,其引物为:正向引物5’-GTCATGATATTCCGCCCCATATT-3’,反向引物5’-CGGTGCGATGAAGTTTATCAAAG-3’;选择金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因,其引物为:正向引物5’-GCTCAGCAAATGCATCACAAAC-3’,反向引物5’-AGCGTTGTCTTCG CTCCAAA-3’。确定多重PCR反应体系中最佳退火温度和引物浓度分别为56℃、0.1μmol/L。经试验,多重PCR检出限为沙门氏菌1.7×103CFU/mL,金黄色葡萄球菌1.3×103CFU/mL。4.农产品加工中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌多重PCR检测试剂盒的研制组装多重PCR检测试剂盒,对试剂盒性能进行评价。试剂盒的特异性试验结果表明,该试剂盒特异性良好,能够准确检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌;灵敏度试验结果表明,试剂盒检出限为沙门氏菌1.7×103CFU/mL和金黄色葡萄球菌1.3×103CFU/mL;重复性试验结果表明,试剂盒的批内、批间重复性良好;稳定性试验结果表明,试剂盒反复冻融处理50次对试剂盒检测效果无明显影响;因试验时间限制,检测试剂盒可在-20℃避光保存9个月。试剂盒对实际样品进行检测,210份样品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检出率分别为6.7%(14/210)、9.5%(20/210),检测结果与国标法检测阳性结果符合率为100%。试剂盒方法在4h-12h便能得到阳性结果,而国标方法需要5-7d才能得出阳性结果。该试剂盒具有特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点,适合于农产品加工中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的快速检测。