药物性肝损伤（Drug-induced liver injury,DILI）是临床最常见的严重不良反应之一,重者可致急性肝衰竭甚至死亡。DILI分为固有性和特异质型,国内外研究表明,目前发现已知的导致肝损伤药物（包括中药）绝大部分是特异质型,具有显著的个体差异,常规毒理学实验难以发现,临床上难以预测。因此,DILI易感人群的识别和预测是当前药物安全领域研究前沿难点和热点。由于中药特异质肝损伤存在复杂性、隐匿性等特点,使易感人群更加难以预测,目前有关中药特异质肝损伤易感人群研究几乎是一个空白。何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.,PM）作为历史悠久的著名补肝肾中药,但近年来何首乌相关肝损伤的问题频繁曝出,也是目前临床导致肝损伤最常见的中药单品种之一。课题组前期研究发现,何首乌相关肝损伤具有较典型的特异质属性,且免疫应激可能是其特异质肝损伤的重要诱因,因此识别和发现其易感人群具有重要意义,然而目前何首乌相关肝损伤易感人群识别国内外尚没有开展系统研究。为此,本论文以何首乌特异质肝损伤为例,通过“临床-实验室-临床”双向转化研究模式,从临床标本和动物模型综合筛查并相互佐证其可能的易感性相关的生物标志物;通过构建单因素和多因素组合的易感人群识别预测模型并检验临床效能;在此基础上结合中医辨证用药减毒理论,综合提出构建基于“病-证-生物标志物”的中药特异质肝损伤易感人群识别策略和研究方法;本论文研究为提高何首乌精准安全用药水平,保障何首乌相关产业健康可持续发展,同时也为其他传统认为“无毒”中药相关肝损伤风险防控提供研究思路和技术支撑。论文主要研究内容和结果如下:1何首乌相关肝损伤的临床特征与易感因素分析研究根据课题组对我国ADR数据统计分析（2012-2016年）,何首乌及制剂相关肝损伤报告在全部中药相关肝损伤中的占比达到13.51%,是中药相关肝损伤报告中最常见的单品种之一。进一步对何首乌相关肝损伤（PM-DILI）的临床特征分析发现:肝损伤病例服用剂量最少1-3g/日,最多超过100g/日;潜伏期最短1-3天,最长超过1年,中位数时间约为4周左右,提示何首乌相关肝损伤服用剂量和潜伏期的跨度较广,没有观察到剂量和时间依赖的相关性;何首乌肝损伤存在典型的药肝家族史,提示可能存在易感基因;综合提示:何首乌肝损伤具有典型特异质属性,可能存在易感人群。其发病年龄跨度大（8-93岁）,女性多于男性,女性以40-59岁居多,男性以20-39岁居多;用药目的主要用于治疗脱发、白发、湿/皮疹、类风湿关节炎、白癜风、银屑病等免疫异常活化或自身免疫性疾病,提示免疫异常活化可能是其特异质肝损伤易感性相关因素,因此筛选与免疫炎症相关的细胞因子、内源性代谢物等可能是PM-DILI易感性相关生物标志物筛查重点。此外,不合理用药是何首乌及制剂导致的肝损伤重要风险因素,包括炮制不规范以及生、制何首乌混淆使用,非传统使用方式（泡酒、打粉、代茶饮、膳食等）。2基于免疫应激模型的何首乌肝损伤相关生物标志物筛查研究针对临床病例筛选出的免疫应激可能是PM-DILI重要易感因素,采用基于课题组前期建立的基于免疫应激（LPS）何首乌特异质肝损伤评价动物模型,考察何首乌肝损伤客观表型与易感性相关生物标志物筛查。结果表明:本研究重现课题组前期何首乌特异质肝损伤客观表型,证实了免疫应激是其重要的易感因素之一,在此基础上针对LPS模拟免疫应激易感因素,与正常对照组比较筛查其血浆细胞多因子发现,MIP-1α,MIP-2,Rantes,MCP-1和IP-10等细胞因子含量表达显著增加（P＜0.05）,提示这些细胞因子可能参与易感性调控的作用;进一步在LPS易感模型基础上,何首乌致肝损伤组发现TNF-a,IL-6和INF-γ等细胞因子表达显著上升（P＜0.05）,提示这些细胞因可能参与肝损伤作用。通过采用PCA分析方法发现与易感性相关主要以趋化因子为主,与肝损伤相关以炎性因子为主。肝组织病理检查发现免疫应激模型组有少量炎性细胞因子浸润但未见明显病理学改变,与肝功能生化指标和炎性细胞因子未升高、血浆趋化因子升高的结果相吻合;提示细胞因子表达上调可能与其易感性高度相关。进一步采用代谢组学筛查与PM-DILI易感性相关的生物标志物,鉴定发现L-Phenylalanine,Creatinine,L-glutamine等9个与易感性相关的代谢生物标志物（ROC AUC均大于0.9）,针对这些差异代谢物通过通路富集分析发现调控代谢通路与急性期反应和炎症反应相关（如苯丙氨酸、酪氨酸和谷氨酸通路）。综合提示基于免疫应激动物模型筛选出与PM-DILI易感性相关的细胞因子和代谢物等生物标志物,暗示其易感性可能与免疫应激有密切的关系,为临床何首乌肝损伤易感人群识别预测研究提供潜在的参考价值。3基于临床标本的何首乌肝损伤相关生物标志物的筛选基于免疫应激动物模型筛选出PM-DILI易感性相关生物标志物,课题组收集了服用何首乌发生肝损伤组18例和无肝损伤组12例,开展临床标本的何首乌肝损伤易感性相关生物标志物筛查研究,通过ROC（AUC＞0.8）曲线预测初步筛选出VEGF,IP-10,Fractalkine,MCP-1,TNF-α和IL-10等6个细胞因子与何首乌肝损伤易感性有密切的相关性。进一步基于前瞻性临床样本对上述筛选易感生物标志物进行了初步验证,通过课题组已收集服用何首乌前患者血清样本,以生化指标ALT＞2ULN定义服用何首乌后有肝损伤和无肝损伤结局比较,通过ROC（AUC＞0.8）曲线筛选出EGF,TNF-α,INF-γ,MCP-1,VEGF和MIP-1α等6个与何首乌肝损伤易感性高度相关。提示:何首乌肝损伤易感性相关生物标志物在临床得到初步验证。进一步采用代谢组学方法筛选临床PM-DILI易感性相关的生物标志物,以课题组收集到服用何首乌肝损伤组8例和无肝损伤组8例临床标本,采用对比鉴定分析并通过ROC曲线筛选发现了Sphinganine-1-phosphate,L-Phenylalanin,N1,N5,N10-Tricoumaroyl spermidine,Bilirubin和L-Histidine（AUC＞0.9）等15个与PM-DILI易感性高度相关生物标志物。此外,采用通路富集分析发现这些筛选差异代谢物主要与炎症反应和免疫调控代谢通路密切相关,如苯丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、花生四烯酸等通路。综合上述临床样本筛选出PM-DILI易感性高度相关细胞因子、代谢物等生物标志物,其中细胞因子MCP-1,TNF-α,IL-10和IP-10及内源性代谢物L-Phenylalanin,N1,N5,N10-Tricoumaroyl spermidine等多个生物标志物与免疫应激动物模型的筛查生物标志物结果重合的。提示:基于临床标本与免疫应激动物模型筛选PM-DILI易感性生物标志物得到相互佐证,该结果为后续建立PM-DILI易感人群识别预测模型提供了数据支撑。4何首乌相关肝损伤易感人群识别效能预测分析研究基于临床标本筛选并验证PM-DILI易感性相关生物标志物研究结果综合提示,免疫因素与何首乌肝损伤易感性密切相关。免疫既包括先天因素如基因突变,也有后天因素机体免疫-代谢共同影响。为此,课题组分别对易感基因、细胞因子、内源性代谢物生物标志物探索建立PM-DILI易感人群识别效能预测模型。其中,易感基因研究与中南大学合作,发现了HLA-B*35:01基因与何首乌肝损伤存在显著相关性,HLA基因是人体主要白细胞抗原主要参与机体免疫调控。本论文重点是针对免疫、代谢组生物标志物开展PM-DILI易感人群识别效能预测。基于上述筛选并验证与PM-DILI易感性高度相关的细胞因子生物标志物,开展了细胞因子单因素和多因素组合何首乌肝损伤易感人群效能模型预测分析研究,结果显示,在单因素基础上筛选发现TNF-α、MCP-1、VEGF、IFN-γ和MIP-1α等5个细胞因子与PM-DILI易感性高度相关,是其独立的易感因素。其中单因素TNF-α（OR 18;95%CI,3.89-83.31）和MCP-1（OR 14.57;95%CI3.23-65.71）细胞因子对PM-DILI易感人群独立预测有很好效能。进一步通过两因素细胞因子组合对PM-DILI易感人群预测效能模型分析显示:（TNF-αAND MCP-1;OR 22.40;95%CI 4.65-107.91）和（TNF-αOR VEGF;OR 45.87;95%CI5.42-435.22）细胞因子组合效能预测模型显著提高。最后通过细胞因子多因素组合筛选发现（TNF-αAND MCP-1 OR VEGF;OR 100;95%CI 10.26-975.05）是最佳PM-DILI易感人群效能预测模型。采用小样本队列验证临床效能发现该细胞因子组合高表达患者发生何首乌肝损伤的风险是非高表达患者的17.5倍,筛选易感细胞因子组合（TNF-αAND MCP-1 OR VEGF）可将何首乌致肝损伤的安全风险由46.67%降至4.76%,降幅达90%。基于前期筛选并验证PM-DILI易感性高度相关的代谢生物标志物,开展了代谢生物标志物单因素和多因素组合的何首乌肝损伤易感人群效能模型预测分析研究。最后结果显示:（Tyrosol OR Betaine）组合代谢生物标志物对PM-DILI易感人群预测效能最佳。通过我们小样本临床队列验证发现,该组合代谢物高表达上调患者发生肝损伤的风险是非表达上调患者的4.3倍,检测代谢生物标志物（Tyrosol OR Betaine）组合可将何首乌致肝损伤的安全风险由50%降至16.67%,降幅达66.67%。综上,基于易感基因、细胞因子、内源性代谢物生物标志物分别建立PM-DILI易感人群效能预测模型,研究发现生物标志物组合对PM-DILI易感人群有更好效能预测,可显著降低何首乌致肝损伤的发病率,为下一步何首乌肝损伤易感人群的风险防控构建提供科学依据。5何首乌肝损伤易感人群的风险防控对策及合理用药建议结合上述何首乌肝损伤病例的临床“病-证”特征研究结果显示:何首乌肝损伤病例以脱发、白发、湿/皮疹、白癜风、类风湿关节炎等免疫异常活化或自身免疫性疾病为主,从中医理论角度认知,患者中医辨证属阴虚火旺、湿热内蕴人群。此外,通过回顾性和前瞻性临床标本分析,发现与何首乌肝损伤高度相关性易感基因生物标志物HLA-B*35:01;发现与炎症和免疫调控相关的细胞因子和趋化因子组合作为何首乌肝损伤易感性生物标志物,如TNF-αAND MCP-1 OR VEGF;发现与炎症和免疫调控相关的内源性代谢物组合作为何首乌肝损伤生物标志物,如（Tyrosol OR Betaine）等。结合中医辨证用药减毒思想,在上述筛选生物标志物组合的基础上,本论文提出了“病-证-生物标志物”特征组合的易感人群识别和肝损伤风险防控新策略,即免疫异常活化类型疾病、中医辨证属阴虚血热、易感生物标志物组合TNF-αAND MCP-1 OR VEGF和Tyrosol OR Betaine表达上调及易感基因HLA-B*35:01突变的患者慎用何首乌。何首乌及其制剂导致肝损伤的风险因素很多,基于上述研究结果提出合理用药建议主要可概括为三方面:一是“人”的原因,避免何首乌肝损伤易感人群用药;二“药”的原因,主要质量安全性控制指标和标准如基原错误、炮制减毒、易感物质含量控制、外源性有害物质污染等;三是“用”的原因,主要合理用药减（避）毒如注意对证用药、配伍减毒、配伍禁忌、不恰当的联合用药等。综上,本论文以何首乌为例,采用临床标本和动物实验结合,从先天和后天因素易感基因、免疫细胞因子和代谢物分别筛选PM-DILI易感性相关生物标志物,综合建立何首乌肝损伤易感人群的生物标志物效能预测模型,且在小样本临床队列有较好预测效能。结合中医辨证用药减毒思想和筛选出于易感性相关生物标志物组合的基础上,综合提出了“病-证-生物标志物”特征组合的易感人群识别和肝损伤风险防控新策略。本论文研究结果为理解以何首乌为代表特异质肝损伤易感机制,建立针对临床基于易感性基因、细胞因子等生物标志物易感人群识别检测试剂盒提供了关键数据支撑;实现了中药临床安全用药的风险防控策略从防控“药”向防控“人”的转变,也为中药精准安全用药提供了研究的范例。后续我们进一步继续扩大多中心,多品种何首乌肝损伤易感人群识别队列验证研究,此外针对何首乌易感物质和易感基因（包括易感性相关的细胞因子）之间相互作用,开展直接靶标的筛选研究,期望从根本上揭示何首乌特异质肝损伤的物质基础和分子机制。