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钙调素（calmodulin，CaM）是一种广泛存在于真核细胞中的Ca2+结合蛋白，CaM-Ca2+作为细胞内信号转导途径中的主要信号分子，介导调控由Ca2+引起的一系列生理生化反应，调节细胞的增殖、分化、运动等过程。近年来的研究发现，钙调素也同样存在于动、植物细胞外，具有促进细胞增殖，神经轴突生长，抑制肿瘤坏死因子的释放，以及促进中性粒细胞蛋白酶分泌等功能，CaM类似于细胞因子和肽类激素的特征，具有细胞外信号功能。有关细胞外CaM的作用机制目前尚不清楚。推测细胞表面可能存在的钙调素结合蛋白（calmodulin-binding proteins, CaMBPs），是介导细胞外CaM和胞内信号转导的桥梁，起到传递细胞外CaM信号的作用。用免疫电镜定位技术，证实细胞表面CaMBPs的存在和观察其在不同细胞表面的分布特征，将有助于深入了解细胞外CaM的作用机制，及其与细胞增殖的关系，为疾病的诊断和治疗提供线索。 已发现植物细胞壁存在CaMBPs。为证实哺乳动物细胞表面CaMBPs的存在，本研究用10nm胶体金标记重组人钙调素（金-rhCaM），分别与人外周血淋巴细胞、小鼠骨髓瘤细胞SP2／0、人胃癌细胞MGC803在体外反应24h后，用透射电镜观察，结果发现上述三种细胞表面均可见散在金颗粒分布，用金标记BSA代替金标记钙调素与上述细胞作用，或淋巴细胞预先用未标记钙调素封闭后再与金-rhCaM反应，透射电镜观察，细胞表面均未见金颗粒分布。提示在人外周血淋巴细胞、小鼠骨髓瘤细胞SP2／0和人胃癌细胞MGC803表面存在rhCaM结合位点（Camodulin-binding site, CaMBS）。从透射电镜结果中也发现，小鼠骨髓瘤细胞（SP2／0）和人胃癌细胞（MGC803）表面CaM结合位点的密度要高于正常人外周血淋巴细胞，提示细胞膜表面CaMBS的分布可能与肿瘤细胞生长相关。 长期以来，钙调素被认为是真核细胞的信号转导分子。但近年来的研究发现，原核细胞中也存在钙调素样蛋白。我们此前的工作也证实外源性CaM可以促进结核分枝杆菌生长。推测原核生物的细胞壁也可能存在CaM结合位点。用金第<sub>军医大学领一卜学位论文一rllCaM与新鲜培养的卡介苗（减毒牛结核分枝杆菌）进行反应，透射电镜观察发现结核分枝杆菌细胞壁存在钙调素结合位点。 大量研究表明，CaM结构与功能的异常以及细胞内CaM含量的变化与某些疾病的发生发展密切相关，检测细胞内外CaM的含量及其与疾病的关系，将有助于进一步探讨CaM的生物学功能及其在某些疾病的发生发展中的作用机制和意义。由于CaM分子结构在进化上的保守性，难以制备特异性的优质抗体，至今还没有理想的CaM检测试剂盒适合于临床常规应用。本研究在研制rhCaM和兔抗CaM抗体的基础上，通过对聚苯乙烯反应板进行紫外线照射处理;改善抗原固相化条件，建立了简便、快速、准确的竞争性ELISA定量方法，经方法学考核，该法具有较高的敏感性，检测CaM的最低下限为4Ong/ml:重复性较好，可用于CaM的定量研究。对淋巴细胞性白血病9例、非淋巴细胞性白血病7例、淋巴瘤7例和82例健康献血员外周血单个核细胞细胞内CaM含量测定结果表明，三组患者中外周血单个核细胞内CaM含量分别为1 349.3士206.38fg/cell、556.06士108.02 fg/cell、1746.05士547.84fg/c ell，显著高于正常对照组（107.16土56.07倒cell）（P<0.01）。提示白血病和淋巴瘤患者单个核细胞内CaM表达水平显著升高。 特异性抗体的制备是建立高特异、灵敏的ELISA检测技术的重要环节。由于CaM抗原分子量小，无种属性差异，很难免疫动物获得高效价、高亲和力的特异性抗血清。因此也限制了ELISA方法的敏感性。噬菌体抗体库技术的发展，为某些难以免疫动物产生特异抗体的抗原，提供了生产单克隆抗体的另一条可行途径。为此，我们采用噬菌体显示技术，利用重组人钙调素为筛选抗原，从人源性噬菌体抗体库中筛选抗CaM特异性抗体，以期得到高效、特异的抗CaM抗体。从天然抗体库中筛选抗原特异性抗体，筛选效率通常较低，成功率远比从免疫抗体库中筛选低得多，技术难度较大。我们经过多次筛选方案改进，得到了阳性噬菌体抗体克隆。用ELI SA试验、钙离子敏感性反应试验、胶体金斑点试验（反相）证实其抗原特异性。得到了抗原结合活性较强的人源性CaM单链噬菌体抗体。我们的改进方案可能对其它抗原的抗体库筛选具有参考意义。