论文部分内容阅读
脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)是一类能够特异性催化水解三酰甘油的酶，在微生物以及动植物中广泛存在，但来源于微生物的脂肪酶由于其活性及稳定性达不到工业生产的需求而限制其应用，因此诸多蛋白改造技术应运而生。 实室前期通过构建土壤宏基因组文库筛选得到的一个全长906bp的新型脂肪酶基因，将其命名为Lip906。由于其热稳定性达不到工业生产的需求，本研究通过易错PCR技术对其分子结构进行改造，通过酶的固定化提高其热稳定性。 通过易错PCR技术构建突变文库，最终筛选得到酶活提高的突变脂肪酶Lip5-D，其发生了两个碱基突变，一个为同义突变：G831A；一个为错义突变：A155G，对应的氨基酸改变为Q52R。突变酶Lip5-D的酶活提高4倍，最适反应温度为60℃，最适反应pH为7.5；突变酶Lip5-D在65℃以下保温2h仍能保持70％左右的相对酶活，在不同pH(3～10)保温2h后仍能保持60%左右的相对酶活，其温度稳定性与pH稳定性都有所提高，表明利用易错PCR技术对酶的分子结构进行改造是可行的。 游离酶对外界环境敏感、反应过程不好控制且游离酶不能循环回收利用，本文利用酶的固定化技术对突变酶Lip5-D进行研究。结果显示，壳聚糖对突变酶Lip5-D游离酶的固定化效果最佳，酶活回收率能达到92%。其最适反应温度为63℃，最适反应pH仍为7.5；固定化后的突变酶在70℃热处理2h后仍保持65%左右的酶活；在不同pH(3～10）保温2h后仍能保持80%左右的酶活，其热稳定性与pH稳定性明显升高；固定化后的酶在4℃和室温储存20天后，残余酶活分别为95.5%、75.7%；存储稳定性显著提高，但是其仅能循环操作6到8次，且固定化后的酶对金属离子以及有机溶剂的耐受性明显降低。