参与蓝莓果实成熟的miRNA与靶基因的鉴定与分析

来源 :北京林业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lizhou555
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蓝莓具有极高的保健价值和经济价值。蓝莓在引种过程中存在着同一品种不同地域风味变淡、品质下降的问题,同时在生产上存在着果实成熟期不一致的现象。探究蓝莓果实成熟的分子机制,可为生产提供理论依据。蓝莓果实的成熟过程非常复杂,不仅包括色泽变化(叶绿素降解和花青苷合成),还包括激素调控、糖酸酯及芳香物质的代谢、果实软化等等一系列过程。参与果实成熟的调控因子,除了人们所熟知的转录因子等,还有广泛参与到植物生长代谢过程的micro RNA。本研究通过高通量测序技术,对北高丛蓝莓‘Legacy’进行转录组测序、s RNA测序和分析,从组学水平鉴定参与蓝莓果实成熟过程中的miRNA。通过一系列生信分析手段,结合生理数据,分析预测miRNA及其靶基因可能参与的果实成熟的各个过程及模式,并结合已发表降解组数据挖掘可能参与果实成熟的miRNA及其靶基因;通过烟草瞬时表达体系证明Vco-miRNA858对其靶基因Vc TT2-type MYB的负调控互作关系。随后,通过苹果果皮瞬时过表达体系和蓝莓稳定遗传转化体系,进行了miRNA和靶基因的功能研究。具体的研究结果如下:(1)‘Legacy’品种蓝莓果实发育周期约为77天。果实生长发育曲线为“双S型”,呈现“慢-快-慢-快”的趋势。果实发育周期大致可分为4个阶段:缓慢生长阶段,即花后7-28 d左右;迅速生长阶段,即花后29-49 d左右;缓慢生长阶段,即花后50-70 d左右;成熟前增长阶段,即花后71-77 d左右。随着蓝莓果实的发育和成熟,叶绿素含量逐渐降低,花青苷的含量逐渐增加。总酚和类黄酮含量变化趋势相近,均呈现先下降,后稍微上升,但总体呈下降的趋势。可溶性总糖、葡萄糖、果糖的含量不断上升,而蔗糖含量则始终处于较低水平。(2)采用BGISEQ-500平台,对‘Legacy’品种蓝莓果实发育成熟过程中的3个关键时期,即未成熟“UR”(DAF=28)、半成熟“SR”(DAF=49)、完全成熟“TR”(DAF=77)进行转录组分析。完成9样品转录组测序,共得到186330条转录本。通过对差异基因的筛选、功能注释与富集,注释到GO数据库的催化活性(catalytic activity)、代谢过程(metabolic process)、细胞进程(cellular process)的基因最多。此外,在KEGG数据库中,富集到光合作用(Photosynthesis)、类黄酮生物合成(Flavonoid biosynthesis)、苯丙烷生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)等通路较多。(3)对‘Legacy’品种蓝莓果实发育过程的关键时期进行s RNA测序,完成9个样品测序,共获得195.61 M Raw Reads。共鉴定出60个已知miRNA,和145个新miRNA。蓝莓已知miRNA分别来自11个miRNA家族,miRNA535家族有13个成员,数量最大。对鉴定到的全部miRNA表达量进行分析,筛选得到81条差异表达的miRNA。对60条已知miRNA和145条新预测miRNA进行靶基因预测和靶基因功能注释与富集。本次测序结果预测得到的miRNA-靶基因对,结合已发表的蓝莓果实降解组数据,筛选得到可能参与果实发育成熟的miRNA-靶基因对。(4)对上述Vco-miRNA858和Vc TT2-type MYB进行功能分析。烟草亚细胞定位实验显示,Vc TT2-type MYB定位于细胞核。利用烟草瞬时表达体系,验证35S::MIR858和35S::TT2-type MYB-GUS之间存在负调控的互作关系。通过苹果果皮异源过表达体系,分别将Vc MIR858和Vc TT2-type MYB基因过表达,结果显示Vco-miR858在调控原花青素生物积累中作用不明显,而Vc TT2-type MYB在原花青素生物合成中起正调控作用。(5)通过侵染蓝莓叶片、共培养、筛选培养后,转化至北高丛蓝莓‘Sierra’叶片,再生获得抗性芽。经过PCR检测,Vc MIR858获得3个芽具有目标条带,其靶基因Vc TT2-type MYB获得2个芽具有目标条带。针对蓝莓转基因苗的生根问题,本研究建立了蓝莓高效生根技术体系。该技术可大大提升蓝莓生根率、缩短生根时间,生根率可达84%以上,13天即可开始生根,45天左右即可移苗。全部转Vc MIR858和Vc TT2-type MYB的蓝莓植株均没有结果实,果实表型需要进一步实验验证。
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