乳铁蛋白肽（Lactoferricin，Lfcin）是乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）经胃蛋白酶水解，从N-端解离下来的一段氨基酸残基，具有乳铁蛋白除转铁功能之外几乎全部的生物学活性，如广谱抗菌、消炎、抑制肿瘤细胞生长及调节机体免疫反应等。但是Lfcin在动物体内含量极微，提取费用昂贵，无法实现大规模生产，因此开展Lfcin基因工程研究具有重要意义。目前对乳铁蛋白肽的研究多集中在原核表达上，但是由于LF及Lfcin对细菌的抗性作用，不能用原核表达系统直接表达具有生物学活性的LF或Lfcin，而乳铁蛋白对于铁需求低的乳酸菌没有抑制作用，本研究自主设计并构建大肠杆菌-乳酸菌双复制子穿梭型猪乳铁蛋白N-端亚基分泌表达载体，以具有自主知识产权的乳酸菌为呈递系统，使目的蛋白得到成功表达。从新疆、黑龙江等地采集各种冻土、野生禽类粪便等样品材料，接种MRS培养基分离具有典型特征的乳酸菌，富集培养后提取乳酸菌的基因组DNA，利用细菌域通用引物扩增16SrDNA序列，连接pMD-18T载体全部进行测序，利用Geneious软件进行细菌的进化树分析，同时，采用法国梅里埃公司API50CHL鉴定试剂盒进行碳水化合物发酵鉴定，筛选出的菌种，进行接种SPF雏鸡的增重试验，每只鸡隔天口服一次，口服菌量大约为6~8*108CFU，每周称重，共6周。根据增重情况筛选出对雏鸡有良好增重作用的乳酸菌2株（4151A1和411-15）；根据益生菌的筛选标准，对2株乳酸菌进行耐酸、耐胆盐、体外抗菌效果评价，最终筛选出4151A1命名为LactobacillussalvariusY1（L.salvariusY1）同时和实验室保存标准菌株L.casei393一起作为本研究的宿主菌。利用本实验室已有条件，自主构建乳糖诱导型表达猪乳铁蛋白N-端亚基的大肠杆菌-乳酸菌双复制子穿梭型分泌表达载体。首先进行双复制子穿梭载体的构建，PCR扩增质粒pMB1的复制子，并与pHE1载体进行克隆连接，得到pHE1-MB1双复制子穿梭载体；然后以乳酸菌质粒pPG612.1为模板扩增其表达盒，与构建的双复制子载体克隆连接得到分泌表达载体pHE1-MB1-612；以pUC59-OPTF为模板扩增出密码子优化的猪乳铁蛋白N-端亚基（OPTF-N），克隆至pHE1-MB1-612上，得到第一个表达猪乳铁蛋白N-端亚基的穿梭型双复制子分泌表达载体pHE1-MB1-612-OPTF-N；再以pHE1-MB1-612-OPTF-N为模板，扩增OPTF-N表达盒（3700bp），克隆至氯霉素抗性双复制子穿梭型载体pGBHC-MB1上，得到第二个表达OPTF-N载体pHC-MB1-612-OPTF-N。将构建完成的2个载体电击转化至自主分离的4151A1和标准菌株L.casei393，得到四株重组乳酸菌，分别命名为r-LactobacillussalvariusY1HC-OPTF-N、r-Lactobacilluscasei393HC-OPTF-N、r-LactobacillussalvariusY1HE1-OPTF-N、r-Lactobacilluscasei393HE1-OPTF-N。将4株重组菌和2株天然菌株接种至乳糖MRS进行乳糖诱导表达，表达产物用免疫斑点实验进行检测，重组乳酸菌发生特异性显色反应，表明目的蛋白在4151A1和L.casei393中成功表达。