论文部分内容阅读
目的:研究不同浓度京尼平对炎性和非炎性条件下KGN细胞株分泌功能及调节通路的影响;证实京尼平具有抗炎性作用,并探讨京尼平在抗炎性作用中可能存在的调节途径。方法:1. 采用CCK-8试剂盒检测不同浓度京尼平对人卵巢颗粒细胞株（KGN细胞株）生长情况的影响:KGN细胞株培养24h后分别加入不同浓度京尼平,浓度分别为:0、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L;CCK-8试剂盒检测不同组别KGN细胞株在0h、12h、24h、48h的OD值,根据OD值制定生长曲线;2.不同浓度京尼平对非炎性状态下KGN细胞株分泌功能及调节通路的影响:KGN细胞株培养24h后给予不同浓度京尼平（浓度分别为:0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L）干预,设置对照组;培养24h后细胞上清液采用Elisa方法检测E2、P、IL-4、IL-5分泌;底层细胞提取蛋白,Western blot方法检测CYP17A1、17β-HSD2、CYP19A1、UCP2蛋白的表达;3.不同浓度京尼平对LPS诱导KGN细胞株炎性反应抑制作用的研究:1)LPS诱导KGN细胞株,建立炎性状态:2ug/ml LPS干预KGN细胞株建立炎性条件;2)京尼平在炎性状态下对KGN细胞株分泌功能及调节通路的影响:LPS干预KGN细胞株24h后分别加入不同浓度京尼平（浓度分别为:0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L）,设置空白组、对照组（LPS组）,24h后留取上清,Elisa方法检测E2、P、IL-4、IL-5,底层细胞提取蛋白,用Western blot方法检测UCP2、17β-HSD2、CYP17A1、CYP19A1、NF-κB蛋白的表达。结果:1. 高浓度京尼平（≥0.1mmol/L）干预KGN细胞株后与对照组比较OD值逐渐降低,且随着京尼平浓度的增加OD值降低越明显,差异有统计学意义（P<0.05）;低浓度京尼平（0.05mmol/L）与对照组比较OD值无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）。2. 不同浓度京尼平对非炎性状态下KGN细胞株的影响:随着京尼平浓度增加,E2、P、IL-4、IL-5分泌逐渐下降,差异均具有统计学意义（P均<0.05）;随着京尼平浓度增加,实验组UCP2蛋白表达与对照组相比明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）;17β-HSD2蛋白表达随着京尼平浓度增加而增加,但差异无统计学意义（P<0.05）;CYP19A1蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）;CYP17A1蛋白表达随着京尼平浓度增加增加,实验组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。3. 不同浓度京尼平对LPS诱导KGN细胞株炎性反应抑制作用的研究:1)氧化应激状态下E2分泌随京尼平浓度增加而逐渐降低,但实验各组与空白组、对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）;氧化应激状态下P分泌随京尼平浓度增加呈逐步下降,实验组与对照组相比,差异无统计学意义（P>0.05）,实验组中0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05）;2)对照组IL-4分泌比空白组略升高,但差异无统计学意义（P>0.05）;实验组与对照组相比IL-4分泌逐步降低,其中0.05mmol/L和0.3mmol/L与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;3)IL-5分泌对照组与空白组相比显著增高,差异有统计学意义（P<0.05）,各实验组IL-5分泌较对照组显著降低,差异均具有统计学意义（P均<0.05）;4)对照组CYP17A1蛋白表达比空白组均显著减少,差异有统计学意义（P<0.05）;实验组CYP17A1蛋白表达与对照组比较呈增多趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;CYP19A1蛋白的表达对照组与空白组和实验组比较差异均无统计学意义（P>0.05）;5)对照组与空白组相比17β-HSD2表达增加,而各实验组与对照组之间比较17β-HSD2蛋白表达无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）;6)对照组与空白组比较UCP2蛋白表达上升,差异有统计学意义（P<0.05）,而实验组与对照组比较UCP2蛋白均下降,但差异无统计学意义（P>0.05）;7)对照组NF-κB蛋白表达比空白组明显增加,实验组NF-κB蛋白表达比对照组降低,但实验组中仅0.1mmol/L组下降最明显,差异统计学意义（P<0.05）。结论:1.本实验予以不同浓度京尼平干预KGN细胞株后,当京尼平浓度≥0.2mmol/L时对KGN细胞株生长抑制作用很明显,且随着京尼平浓度的增加抑制作用越明显。2.不同浓度京尼平干预KGN细胞株后,IL-4、IL-5的分泌及UCP2蛋白表达均下降,提示京尼平对非炎性状态下KGN细胞株具有抗炎性作用,UCP2可能是调节抗炎性作用的蛋白之一;非炎性状态下随着京尼平浓度增加而雌孕激素水平逐渐降低,而UCP2变化有差异,推测雌孕激素除了受关键酶调节,UCP2可能存在一定调节作用。3. 炎性条件下IL-4、IL-5分泌均增高,表明LPS诱导KGN细胞株氧化应激模型成功建立;京尼平干预炎性条件下KGN细胞株后IL-4、IL-5炎性指标及UCP2和NF-κB蛋白表达均降低,提示京尼平对炎性状态下KGN细胞株具有抗炎性作用,其抗炎性作用可能是通过NF-κB通路和UCP2等多种途径调节。4. 本实验初步探索了京尼平对氧化应激状态下KGN细胞株的作用,为后续京尼平在生殖系统中的研究提供前期实验基础。