论文部分内容阅读
目的：
探讨PRC17蛋白对Ras-Erk1/2途径的作用，明确其细胞恶性转化相关的重要功能区域，将有助于阐明其细胞恶性转化的机制，为人类细胞恶性转化模型的建立和人类肿瘤的早期诊断和防治提供新的思路。
方法：
以HA-pcDNA3空载体为阴性对照，将HA-PRC17或GST-PRC17用Lipofectamine2000方法或Lipofectamine与Plus方法分别转染COS-7或NIH 3T3细胞，以0.1％低浓度小牛血清-DMEM培养液饥饿细胞18 h后,检测其磷酸化Erk1/2和总Erk水平；将HA-PRC17或HA-pcDNA3空载体瞬时转染NIH 3T3细胞，通过含有700μg·ml<-1> G418的10％小牛血清-DMEM培养液筛选2～3周后得到稳定转染的细胞株，并通过软琼脂克隆形成实验得到PRCl7恶性转化的NIH 3T3细胞；将未转染的、稳定转染HA-pcDNA3空载体或癌基因PRC17的NIH 3T3细胞及PRC17恶性转化的NIH 3T3细胞，分别以0.1％低浓度血清-DMEM培养液饥饿 18 h 或饥饿后以10％高浓度血清-DMEM 培养液刺激5 min，检测其磷酸化Erk1/2和总Erk水平；以含有MEK抑制剂PD98059(50μM)或DMSO的培养液处理未转染的、稳定转染HA-pcDNA3空载体或PRC17的NIH 3T3细胞及PRC17恶性转化的NIH 3T3细胞48 h或24 h后，用软琼脂实验进行细胞恶性转化分析，或以0.1％低浓度血清培养液饥饿后以10％高浓度血清培养液刺激5 min，检测其磷酸化Erk1/2和总Erk水平；用RT-PCR的方法从HeLa细胞中扩增Rafl与活化Ras结合的功能区域(Ras binding domain，RBD)，即Rafl(187)的cDNA，克隆至pGEX表达载体中，在BL21细菌中大量表达并纯化该融合蛋白OST-Rafl(RBD)，利用GST Pull-down方法检测未转染、稳定转染HA-pcDNA3空载体或PRC17的NIH 3T3细胞及PRC17恶性转化的 NIH 3T3 细胞中活化Ras的水平。使用PCR方法构建癌基因PRC17羧基端缺失变异体HA-PRC17(251)/pcDNA3，HA-PRC17(353)/1 本课题受国家自然科学基金项目 (30570696)和 (30670808)资助pcDNA3和HA-PRC17(476)/pcDNA3，使用overlap extension PCR方法构建PRC17的单点变异体HA-PRC17(R107P)/pcDNA3和双点变异体HA-PRC17(R107P,D148H)/pcDNA3，稳定转染NIH 3T3细胞，Western Blotting分析检测各变异体融合蛋白的表达，用软琼脂实验进行细胞恶性转化能力分析。
结果：
与未转染的细胞和瞬时转染空载体的细胞相比较，在COS-7或NIH 3T3细胞中瞬时转染HA-PRC17或GST-PRC17，将引起细胞的磷酸化Erk1/2水平上调，而总Erk水平无显著变化；与未转染的和稳定转染HA-pcDNA3空载体的NIH 3T3细胞相比，PRC17稳定转染和恶性转化的NIH 3T3细胞单纯饥饿 18 h后，其磷酸化Erk1/2水平明显上调而其总Erk水平无显著变化；同样饥饿18 h后以高浓度血清刺激使转染或未转染的NIH 3T3细胞磷酸化Erk1/2水平均出现显著的上调；与DMSO对照组处理24 h后磷酸化Erk1/2水平显著上调相比较，PRC 17稳定转染和恶性转化的NIH 3T3细胞经过PD98059同样处理后磷酸化Erk1/2水平均呈现显著下调而总Erk水平无显著变化；软琼脂实验分析未转染的和稳定转染HA-pcDNA3空载体的NIH 3T3细胞经过PD98059/DMSO处理后，生长并无明显变化，克隆形成率均在0％～1％左右；PRC17稳定转染和恶性转化的NIH 3T3细胞经过PD98059处理后生长减慢，克隆形成率分别由38％和37.5％下降至9％和8.5％：GST Pull-down显示与未转染的和稳定转染HA-pcDNA3空载体的NIH 3T3细胞相比，PRC17稳定转染和恶性转化的NIH 3T3细胞中活性Ras水平呈现上调而总Ras水平无显著变化。软琼脂实验分析PRC17和其变异体细胞恶性转化能力：与未转染细胞和空载体转染细胞相比，稳定转染PRC17、变异体PRC17(476)和PRC17(353)的NIH 3T3细胞能够在软的琼脂上很好的生长并形成克隆，其克隆形成率分别高达40％、39％和35％，变异体PRC17(251)的羧基端缺失变异使细胞恶性转化率减小为6％；其GAP活性区重要位点第107位精氨酸单点变异使细胞恶性转化率减小为28％，107位精氨酸和148位天门冬氨酸双点变异导致细胞恶性转化率进一步降低(11％)。
结论：
1．PRC17在NIH 3T3细胞中过表达可激活Ras-Raf-MEK1/2-Erk1/2信号转导途径。
2．除GAP功能区保守位点107位精氨酸和148位天门冬氨酸外，癌基因PRC17的氨基酸251～353也可能是其细胞恶性转化功能的重要区域。