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目的本研究基于血管性痴呆（Vascular dementia,VaD）缺血性脑白质损伤的病理特征及髓鞘的重要生理功能,推测髓鞘受损可能是VaD患者出现抑郁焦虑症状的重要病理基础。通过在体和离体实验探讨逍遥散及有效单体槲皮素对VaD伴抑郁焦虑小鼠脑内小胶质细胞表型转化,及其对髓鞘损伤后吞噬髓鞘碎片能力的影响,阐明其减轻髓鞘损伤改善VaD小鼠的抑郁焦虑表型的作用机制。同时,旨从脏腑阴阳气血失调,肝失疏泄,气机不畅的角度探讨VaD伴抑郁焦虑的病因病机,通过我们的研究,能更好的理解疾病的发生机制并发现新的干预靶点,以期为疾病的干预和治疗提供新的研究思路和药物选择。方法1.第一部分理论探讨:根据中医肝的生理功能、肝脑经络相连的解剖关系以及从肝论治郁证的现代医学认识几个维度探讨从肝论治VaD后郁证的理论基础,回顾目前对逍遥散及其有效单体治疗抑郁焦虑状态的研究进展,深入分析脑慢性低灌注导致髓鞘受损,神经网络的稳态失衡与抑郁焦虑状态发生的相关性;根据肝主一身之气理论探讨神经网络稳态与郁证（VaD伴抑郁焦虑）病机的关联,为诠释VaD伴抑郁焦虑的中医治疗原则及逍遥散及有效单体槲皮素通过促进小胶质细胞表型转化,增强吞噬能力从而减轻髓鞘损伤改善VaD伴抑郁焦虑表型提供理论依据。2.第二部分逍遥散改善血管性痴呆小鼠抑郁焦虑表型的作用机制实验一:SPF级3月龄雄性的C57BL/6小鼠（体质量24-30g）共90只,随机选取10只作为对照（Control）组予BCAS假手术,剩余80只予BCAS术后经水迷宫实验筛选出学习记忆能力下降的小鼠进行CRS（每日6h,共2周）诱导VaD伴抑郁焦虑小鼠模型,随机分为模型组、氟西汀组（Fluoxetine）、逍遥散低剂量组（XYP-L）、中剂量组（XYP-M）、高剂量组（XYP-H）,每组各10只。低、中、高剂量逍遥散组小鼠给予的生药剂量分别为5、10、20g/kg的逍遥散水煎剂,氟西汀组小鼠给予氟西汀溶液,均按照小鼠体重0.1m L/10g灌胃给药,Control组和模型组等量生理盐水灌胃,每日一次,共计4周,给药过程中同时继续CRS维持。通过悬尾实验、强迫游泳实验、高架十字迷宫实验、旷场实验、糖水偏好实验检测各组小鼠抑郁焦虑行为表型。实验二:动物分组及干预同实验一,免疫荧光法检测各组小鼠腹侧海马（v HIP）髓鞘碱性蛋白（MBP）荧光表达水平;透射电镜观察小鼠v HIP脑区髓鞘超微结构;蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测MBP、少突胶质细胞糖蛋白（MOG）、髓鞘相关醣蛋白（MAG）、髓样细胞触发性受体-2（TREM2）、诱导型一氧化氮合酶（i NOS）、精氨酸酶1（Arg1）、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-10（IL-10）蛋白表达水平;透射电镜观察各组小鼠v HIP脑区髓鞘的超微结构。3.第三部分逍遥散有效单体槲皮素通过促进小胶质细胞吞噬能力减轻髓鞘损伤改善VaD小鼠伴抑郁焦虑表型在体实验:SPF级3月龄雄性的C57BL/6小鼠（体质量24-30g）分为四组:Sham组:假手术+无束缚小鼠+不含槲皮素的溶液;Que组:假手术+无束缚小鼠+槲皮素溶液;BCAS/CRS组:BCAS/CRS+不含槲皮素的溶液;BCAS/CRS+Que组:BCAS/CRS+槲皮素溶液。在BCAS小鼠进行水迷宫实验筛选后,按小鼠体重60mg/kg腹腔注射槲皮素（Que）溶液,每日1次,共14天,同时给予CRS。通过悬尾实验、强迫游泳实验、糖水偏好实验、旷场实验、高架十字迷宫实验等行为学检测各组小鼠抑郁焦虑行为表型;Western Blot检测MBP、MOG、MAG、i NOS、CD86、Arg1、CD206、IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10蛋白表达水平;免疫荧光法检测各组小鼠v HIP MBP荧光表达水平、M1型小胶质细胞（i NOS与Iba1共同标记）与M2型小胶质细胞（Arg1与Iba1共同标记）的阳性细胞百分比、小胶质细胞吞噬髓鞘的阳性细胞百分比（MBP与Iba1共同标记）;LFB染色观察各组小鼠v HIP脑区髓鞘损伤分级情况;透射电镜观察各组小鼠v HIP脑区髓鞘的超微结构改变及g-ratio值。体外实验:取P0-P2的C57/BL6新生鼠培养原代小胶质细胞,免疫荧光鉴定培养的细胞中小胶质细胞纯度后,继续培养至小胶质细胞呈静息态进行后续实验。实验分组为:（1）Control组;（2）Control+Quercetin 30μM组;（3）Control+Quercetin 60μM组;（4）OGD;（5）OGD+Quercetin 30μM组;（6）OGD+Quercetin 60μM组;细胞药物干预流程:小胶质细胞在氧糖剥夺（Oxygen glucose deprivation,OGD）前使用不同浓度的槲皮素预处理2h后进行OGD 2h,随后再给予不同浓度的槲皮素干预24h,收获细胞蛋白或多聚甲醛固定,进行指标检测。免疫荧光法检测各组M1型小胶质细胞阳性细胞百分比（Iba1与i NOS共同标记）与M2型小胶质细胞阳性细胞百分比（Iba1与Arg1共同标记）;Western blot法检测各组小胶质细胞i NOS、Arg1、CD86、CD206蛋白表达水平;ELISA检测各组原代小胶质细胞分泌的IL-4、IL-10、TNF-α、IL-1β细胞因子水平;细胞髓鞘碎片吞噬实验流程:各组小胶质细胞同前予OGD及不同浓度的Que干预处理。在药物干预12h后,各组细胞加入髓鞘碎片浓度为1mg/m L,共同孵育12h后多聚甲醛固定,进行免疫荧光染色观察小胶质细胞形态变化以及小胶质细胞吞噬髓鞘碎片情况（Iba1与MBP共同标记阳性细胞百分比）。结果第二部分逍遥散改善血管性痴呆小鼠抑郁焦虑表型的作用机制实验一:各组小鼠行为学检测结果显示:与Control组相比,模型组小鼠在高架十字迷宫和糖水偏好实验中进入开放臂时间百分比、开放臂次数百分比、糖水偏好百分比均下降（P＜0.01）,在强迫游泳实验和悬尾实验中不动时间明显增加（P＜0.01）,旷场实验中总运动距离、中心区域运动时间、修饰次数明显减少（P＜0.01）;与模型组相比,逍遥散高、中剂量组小鼠在高架十字迷宫和糖水偏好实验中进入开放臂时间百分比、开放臂次数百分比均明显增加（P＜0.05,P＜0.01）,糖水偏好百分比增加（P＜0.01）,在强迫游泳实验和悬尾实验中的不动时间缩短（P＜0.05,P＜0.01）,旷场实验中中心区运动距离、中心区域运动时间、修饰次数明显增加（P＜0.01）,氟西汀组小鼠在高架十字迷宫进入开放臂时间百分比、开放臂次数百分比增加（P＜0.05）,在强迫游泳实验和悬尾实验中的不动时间缩短（P＜0.01）,糖水偏好实验中糖水偏好百分比增加（P＜0.05）,旷场实验中总运动距离、中心区域运动时间明显增加（P＜0.01）;高剂量逍遥散组与氟西汀组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。实验二:1.Western blot结果显示:与Control组相比,模型组小鼠v HIP脑区中髓鞘相关蛋白（MBP、MOG、MAG）表达均下降（P＜0.01）;与模型组相比,低剂量组小鼠v HIP脑区中MBP、MOG、MAG蛋白表达增加（P＜0.05,P＜0.01）,i NOS蛋白表达降低（P＜0.01）,中、高剂量组MBP,MOG,MAG,TREM2,Arg1,IL-4,IL-10蛋白表达均增加（P＜0.05,P＜0.01）,i NOS,IL-1β,TNF-α蛋白表达水平降低（P＜0.01）;2.免疫荧光染色结果显示:与Control组相比,模型组小鼠v HIP脑区MBP平均荧光强度降低（P＜0.01）,与模型组小鼠相比,低、中、高剂量组小鼠v HIP脑区MBP平均荧光强度均明显增加（P＜0.01）;3.透射电镜结果显示:与Control组相比,模型组小鼠v HIP区髓鞘结构松解,致密层分离,排列紊乱,给予逍遥散干预后可促进小鼠v HIP区髓鞘结构完整性,减轻髓鞘板层结构松散度。第三部分逍遥散有效单体槲皮素通过促进小胶质细胞吞噬能力减轻髓鞘损伤改善VaD小鼠伴抑郁焦虑表型在体实验:1.各组小鼠行为学检测结果显示:与Sham组相比,模型组小鼠在高架十字迷宫和糖水偏好实验中进入开放臂时间百分比、开放臂次数百分比、向下探身次数、糖水偏好百分比均下降（P＜0.01）,在强迫游泳实验和悬尾实验中不动时间明显增加（P＜0.01）,旷场实验中中心区域运动距离、中心区域运动时间、修饰次数明显减少（P＜0.01）,单纯Que组与Sham组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。与BCAS/CRS组相比,BCAS/CRS+Que组小鼠在高架十字迷宫和糖水偏好实验中进入开放臂时间百分比、开放臂次数百分比、向下探身次数均增加（P＜0.05）,糖水偏好百分比明显增加（P＜0.01）,在强迫游泳实验和悬尾实验中的不动时间明显缩短（P＜0.01）,旷场实验中总运动距离、中心区域运动时间明显增加（P＜0.01）,修饰次数增加（P＜0.05）。2.Western blot结果显示:与Sham组相比,BCAS/CRS组小鼠v HIP脑区MBP、MAG、MOG髓鞘相关蛋白表达明显下降（P＜0.01）,i NOS、CD86、IL-1β、TNF-α蛋白表达明显升高（P＜0.01）,Arg1蛋白表达无差异（P＞0.05）、CD206、IL-4、IL-10蛋白表达明显升高（P＜0.01）;与BCAS/CRS组相比,BCAS/CRS+Que组小鼠v HIP脑区MBP、MAG、MOG髓鞘相关蛋白表达明显升高（P＜0.05,P＜0.01）,INOS、CD86、IL-1β、TNF-α蛋白表达明显下降（P＜0.01）,Arg1、CD206、IL-4、IL-10蛋白蛋白表达明显升高（P＜0.01）。3.免疫荧光染色结果显示:与Sham组相比,BCAS/CRS组小鼠v HIP脑区MBP荧光表达强度明显降低（P＜0.01）,M1型小胶质细胞（i NOS与Iba1共同标记）与M2型小胶质细胞（Arg1与Iba1共同标记）的阳性细胞百分比增加（P＜0.05,P＜0.01）,小胶质细胞吞噬髓鞘的阳性细胞百分比（MBP与Iba1共同标记）增加（P＜0.05）;与BCAS/CRS组相比,BCAS/CRS+Que组小鼠v HIP脑区MBP荧光表达强度增加（P＜0.05）,M1型小胶质细胞阳性细胞百分比降低（P＜0.01）,M2型小胶质细胞的阳性细胞百分比增加（P＜0.01）,小胶质细胞吞噬髓鞘的阳性细胞百分比显著增加（P＜0.01）。4.LFB染色结果显示:与Sham组相比,BCAS/CRS组小鼠v HIP和胼胝体脑区髓鞘结构疏松,着色变浅,神经纤维排列紊乱,并伴有空泡形成等髓鞘损伤（P＜0.01）,与BCAS/CRS组相比,BCAS/CRS+Que组小鼠v HIP和胼胝体脑区的髓鞘损伤有一定地减轻,髓鞘纤维排列较有序,蓝染较清晰（P＜0.05）。5.透射电子显微镜结果显示:有髓神经纤维的髓鞘厚度常用g-ratio来表征,g-ratio值越大,说明髓鞘越薄。通过分析可以发现,与Sham组相比,BCAS/CRS组小鼠v HIP脑区有髓纤维g-ratio值明显升高（P＜0.01）,髓鞘致密层结构松解、融合,部分髓鞘可见断裂,排列紊乱,与BCAS/CRS组相比,BCAS/CRS+Que组小鼠v HIP脑区髓鞘板层排列较有序,板层结构松散程度明显减轻（P＜0.05）。体外实验:1.Western blot结果显示,与Control组相比,30μM Que组和60μM Que组i NOS和CD86蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）,OGD组i NOS和CD86蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）,30μM和60μM槲皮素干预后可以显著下调i NOS和CD86蛋白表达（P＜0.01）,与OGD+30μM Que组相比,OGD+60μM Que组的i NOS和CD86蛋白表达最低（P＜0.01）;与Control组相比,30μM Que组和60μM Que组Arg1和CD206蛋白表达之间差异无统计学意义（P＞0.05）,在OGD条件下Arg1和CD206的蛋白表达也一定地升高（P＜0.01）,30μM和60μM槲皮素干预后Arg1和CD206蛋白表达显著增加（P＜0.01）,与OGD+30μM Que组相比,OGD+60μM Que组Arg1和CD206蛋白表达较高（P＜0.01）。2.免疫荧光染色结果显示:与Control组相比,30μM Que组和60μM Que组i NOS+/Iba1+细胞百分比之间差异无统计学意义（P＞0.05）,OGD组该百分比显著增加（P＜0.01）,予30μM和60μM槲皮素干预后,i NOS+/Iba1+细胞百分比显著下降（P＜0.01）,OGD+60μM Que组i NOS+/Iba1+细胞百分比最低（P＜0.01）;30μM Que组和60μM Que组Arg1+/Iba1+细胞百分比之间有一定地增加,但差异无统计学意义（P＞0.05）,OGD组该百分比显著增加（P＜0.01）,予30μM和60μM槲皮素干预后,Arg1+/Iba1+细胞百分比增加（P＜0.01）,OGD+60μM Que槲皮素具有更Arg1+/Iba1+细胞百分比最高（P＜0.01）;与Control组相比,Que（30μM）组和Que（60μM）组MBP++Iba1+/Iba1+细胞的百分比明显增加（P＜0.01）,随后在OGD条件下,与OGD组相比,OGD+Que（30μM）组、OGD+Que（60μM）组MBP++Iba1+/Iba1+细胞的百分比增加（P＜0.01）,并且不同的浓度干预差异无统计学意义（P＞0.01）。3.ELISA检测结果显示:与Control组相比,OGD条件促使促炎因子IL-1β和TNF-α的含量显着增加（P＜0.01）,30μM和60μM槲皮素干预后,IL-1β和TNF-α的含量显着下降（P＜0.01）,60μM槲皮素抑制炎症因子的效果较好（P＜0.05）;与Control组相比,Que（30μM）组和Que（60μM）组的抗炎因子IL-10和IL-4含量差异无统计学意义（P＞0.05）,OGD条件也促使抗炎因子IL-10和IL-4含量显著增加（P＜0.01）,与OGD组相比,OGD+Que（30μM）组、OGD+Que（60μM）组IL-10和IL-4的含量增加（P＜0.05,P＜0.01）,OGD+Que（60μM）组IL-10和IL-4的水平最高（P＜0.05,P＜0.01）。结论1.逍遥散从肝论治VaD伴抑郁焦虑具有充分的理论基础和临床应用价值。为诠释VaD伴抑郁焦虑的中医治疗原则以及逍遥散与有效单体槲皮素通过促进小胶质细胞表型转化,增强吞噬能力从而减轻髓鞘损伤改善VaD伴抑郁焦虑表型提供理论依据。2.通过采用BCAS结合CRS构建VaD伴抑郁焦虑小鼠动物模型,可再现临床中VaD患者的脑白质变性（髓鞘损伤）的病理特点和认知功能下降及抑郁焦虑状态的临床症状,此造模方法成模率高,有效可行。逍遥散可通过上调VaD小鼠v HIP脑区TREM2蛋白表达以促进小胶质细胞表型转化,抑制炎症反应及促进抗炎因子的释放减轻髓鞘损伤,有效改善小鼠的抑郁焦虑表型。3.逍遥散有效单体槲皮素通过促进VaD小鼠v HIP脑区小胶质细胞表型转化,增加其吞噬髓鞘碎片能力减轻髓鞘损伤,从而改善小鼠的抑郁焦虑表型。