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丝状真菌的蛋白分泌能力极强,它不仅拥有的完整真核细胞转录翻译系统,还拥有蛋白质翻译后加工修饰系统。其中,黑曲霉最具代表性。微生物表面展示技术,可将外源蛋白的基因与特定的锚定蛋白基因融合表达,通过锚定蛋白的锚定作用,将酶固定化在细胞表面。表面展示技术比起常规固定化方法,不仅可以很好地保持外源蛋白的活性,还可以大大降低固定化的成本。CALB(南极假丝酵母脂肪酶B)具有较高的催化活性和底物选择性,可以催化多种有机相反应。目前,已有关于黑曲霉外源蛋白表达体系的报导,但尚无对黑曲霉表面展示CALB的发酵条件进行研究,也没有关于该展示酶在月桂酸丁酯生物合成方面的研究报导。首先,本实验在摇瓶水平研究了诱导碳源种类、诱导温度对菌体生长和发酵产酶的影响,然后,在2L-发酵罐水平研究了诱导pH、诱导碳源浓度、诱导DO对菌体生长、发酵产酶和菌体形态的影响。通过考察以上5种因素,得到了最终确定的2L发酵罐发酵条件:菌体生长期,接种量20%,摇瓶菌体OD=4-6,种龄2d,发酵罐装液量1L,培养基APY,碳源Sucrose,初始碳源浓度1%,恒定pH6.0(氨水流加),恒定温度30℃,恒转速500rpm(不控制DO),恒通气量3.0Lpm;诱导期,维持残余葡萄糖浓度5mmol/L,转速联动控制DO 30%,其他条件保持不变。在此工艺条件下,表面展示CALB酶活力可以达到1001U/g,菌体OD600可达5.7,折算菌体干重19g/L,比摇瓶水平提高了242.8%。另外,本实验还考察了反应时间、底物浓度、底物摩尔比、酶添加量、反应温度等5个基本工艺条件对产物产率和反应初速度的影响。通过条件优化得到的最佳工艺条件为:反应体系10mL,溶剂正己烷,月桂酸浓度75 mmol/L,月桂酸丁醇摩尔比1:1.2,黑曲霉展示CALB脂肪酶0.1g,反应温度60℃,分子筛0.2 g,搅拌转速200r/min,反应3h。在此条件下,月桂酸丁酯的产物产率达到了92.1%,生产强度为2.3mmol·g-1·h-1。在最优工艺下对黑曲霉表面展示CALB催化反应进行10个批次的重复,相对产率仅下降4.27%,证明了黑曲霉表面展示CALB在该体系下催化月桂酸丁酯合成反应中的操作稳定性。本研究为黑曲霉表面展示CALB的工业生产奠定了基础,并利用获得的全细胞催化剂,进行月桂酸丁酯的生物制备,为黑曲霉表面展示CALB的工业应用准备条件。