多胺（polyamine）广泛存在于生物体内的各组织细胞中,是重要的代谢调控物质。在肿瘤组织中多胺的含量明显升高。鸟氨酸脱羧酶（ODC）是多胺生物合成的第一个关键酶,在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。1992年Auvinen等首次在Nature上发表论文,认为ODC活性增高能促进细胞转化。S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）是多胺合成的第二个限速酶,可以促进细胞的的恶性转化。文献报道SAMDC较ODC是更为有效的细胞转化的诱导因子。抑制多胺代谢途径成为治疗肿瘤的有效途径。相应的化学抑制剂如二氟甲基鸟氨酸（DFMO）、APA、CGP48664和AMA虽然在体内外的抑癌作用良好,但其严重的毒副作用极大的防碍了临床应用。寻找一种更高效更低副作用的抑制多胺合成途径的方法势在必行。如今,美国已启动600多个基因治疗的临床实验,其中60%是关于癌症治疗的。其中腺病毒介导的基因转染途径在癌症的基因治疗中特别引人关注,因为腺病毒的DNA不能整合到宿主基因组中,也不能感染卵细胞,具有很高的生物安全性。迄今为止,基因治疗的临床实例中近30%采用的是腺病毒载体。国内外研究证明反义核酸技术是比较理想的一种基因治疗方法,构建能转录反义RNA的重组载体在细胞内不断地转录出反义RNA,抵消酶解作用,发挥较持久的治疗效应。基因治疗在当今临床已经产生令人振奋的研究结果,但它的靶向安全性仍然是人们关注的焦点。许多肿瘤组织特异性启动子已被人类所认识,hTERT基因启动子更是备受关注。体外转基因实验中分别采用hTERT启动子与CMV启动子来转染不同的肿瘤细胞系,包括人肺癌细胞系（CH1299和A549）,结肠癌细胞系（DLD1和LoVo）,人宫颈癌细胞Hela及两种正常细胞系,结果显示:对于肿瘤细胞,hTERT启动子的转基因表达效率较CMV高2-3倍;而就正常细胞来说,CMV转基因的表达比hTERT高500多倍,这充分展示了hTERT启动子在肿瘤细胞中转基因表达的高效性与特异性。此后进行的体内直接转基因实验也证实了这一点。据此,本课题拟将ODC、SAMDC的反义基因分别构建入pAdEasy1系统,由人端粒酶逆转录酶启动子（hTERTp）启动表达,检测重组病毒对肿瘤细胞的特异抑制作用,为肿瘤疾病的靶向性基因治疗奠定基础。第一部分细胞端粒酶活性检测及外源hTERT启动子活性检测【研究目的】检测本实验中拟使用的五株细胞中端粒酶的活性,并检测端粒酶催化亚基启动子在肿瘤细胞系和正常细胞系中的启动活性,为下一步人端粒酶逆转录酶启动子启动的ODC、SAMDC反义病毒载体的构建奠定基础。【研究方法】（1）体外稳定培养肿瘤细胞系（人肺癌细胞系A549、人肝癌细胞系Bel-7402、HepG2）及正常细胞系（人胚肺成纤维细胞HELF、人肝细胞LO2）。（2）提取各株细胞端粒酶蛋白,利用TRAP法进行端粒酶活性的检测,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果。即将10μlTRAP产物与含溴酚蓝的6×凝胶载样缓冲液2μl混合,在120V的电压下,进行12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,直至电流使溴酚蓝色带泳出凝胶为止。固定银染显色后,出现4条以上间隔6bp的梯度条带者为端粒酶活性阳性。（3）将带有由人端粒酶逆转录酶启动子（hTERTp）启动的指示基因luc的重组质粒（pGL3-hTERT-luc,由美国肯塔基大学微生物教研室惠赠）,转入各株培养细胞。（4）通过双荧光素酶法检测指示基因luc的表达活性,从而反映hTERT启动子在肿瘤细胞和正常细胞中的启动活性。【实验结果】（1）利用TRAP法进行端粒酶活性的检测,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示:对于肿瘤细胞系（A549、Bel-7402和HepG2）,均具有大于4条以上的阳性带;而对于正常细胞系（HELF和LO2）,均未见阳性条带出现。（2）双荧光素酶法检测结果显示,在肿瘤细胞系中,hTERT启动子的比活性分别是:A549细胞为4.5±0.25;Bel-7402细胞为5.1±0.24;HepG2细胞为4.9±0.3。而在正常细胞中,hTERT启动子的比活性分别是:HELF细胞为0.16±0.02;LO2细胞为0.11±0.01。【结论】本实验中拟使用的三株肿瘤细胞（A549、Bel-7402和HepG2）,其端粒酶活性为阳性;而对应的两株正常细胞（HELF和LO2）,其端粒酶活性为阴性。荧光素酶活性检测显示:hTERT启动子在肿瘤细胞中具有较强启动活性而在正常细胞中未见有明显活性。第二部分hTERT启动子介导的人ODC、SAMDC反义腺病毒载体的构建【研究目的】分别构建由人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp介导ODC和SAMDC反义RNA表达的腺病毒载体,为在肿瘤细胞中靶向性抑制多胺合成提供新工具和手段。【研究方法】（1）应用PCR方法扩增出ODC mRNA翻译起始位点区120bp的基因片断,和SAMDC mRNA翻译起始位点区205bp的基因片断。PCR扩增产物和带有hTERT启动子的质粒pGL3-hTERT-luc均经XbaI、NcoI双酶切,回收质粒酶切长片段和PCR酶切产物片段。（2）将ODC和SAMDC回收片段分别与pGL3-hTERT-luc酶切长片段（-pGL3-hTERT-）进行连接,分别构成了pGL3-hTERT-ODC和pGL3-hTERT-SAMDC重组质粒。（3） KpnI和SalI双酶切pGL3-hTERT-ODC和pGL3-hTERT-SAMDC重组质粒,回收短片段（-hTERT-ODC-和-hTERT-SAMDC-）与经KpnI和SalI双酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack长片段连接。分别构成pAdTrack-hTERT-ODC和pAdTrack-hTERT-SAMDC重组质粒。（4）重组质粒经PmeI酶切线性化后,转入Adeasy-1细菌与pAdeasy-1质粒发生同源重组。挑选阳性重组质粒pAdeasy-hTERT-ODC和pAdeasy-hTERT-SAMDC,经PacI酶切后,转染293细胞包装和扩增出腺病毒颗粒。荧光显微镜和PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定。【实验结果】（1）采用PCR方法扩增出120bp、205bp的ODC、SAMDC基因片断,经电泳鉴定正确。（2） pGL3-hTERT-ODC和pGL3-hTERT-SAMDC重组质粒经XbaI、NcoI双酶切分别得到120bp、205bp小片段和4.5kb大片段,经测序鉴定正确。（3） pAdTrack-hTERT-ODC和pAdTrack-hTERT-SAMDC重组质粒经PCR扩增分别得到长120bp的ODC片断和长205bp的SAMDC片断,经测序鉴定此序列正确。（4）重组质粒pAd-hTERT-ODC和pAd-hTERT-SAMDC分别经PacⅠ酶切得4.5kb和35kb两个片段。（5）重组质粒pAd-hTERT-ODC和pAd-hTERT-SAMDC分别转染293细胞进行包装扩增,可见明显病毒空斑形成,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白在293细胞中表达。扩增后腺病毒滴度为2×10⁹pfu/ml,PCR证实两个重组质粒基因组中分别含有目的基因ODC和SAMDC。【结论】成功构建了由人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp介导ODC反义RNA表达的腺病毒载体rAd-hTERT-ODC和SAMDC反义RNA表达的腺病毒载体rAd-hTERT-SAMDC,为肿瘤疾病的靶向性基因治疗和预防提供了必要的侯备工具。第三部分两组反义腺病毒载体靶向性抑制肿瘤细胞增殖作用的研究【研究目的】研究两组重组腺病毒rAd-hTERT-ODC/SAMDC（rAd-hTERT-ODC和rAd-hTERT-SAMDC）对五株细胞（A549、Bel-7402、HepG2、HELF和LO2）中ODC、SAMDC基因表达的下调作用,并观察其对肿瘤细胞增殖以及侵袭能力的靶向抑制作用。【研究方法】（1）将两组重组腺病毒载体分别转染入上述五株细胞,通过MTS法测定不同MOI的腺病毒对各株细胞的转染效率,以找到不同细胞的最适感染滴度。rAd-hTERT-ODC/SAMDC分别以最适感染滴度感染人肺癌细胞系A549、人肝癌细胞系Bel-7402、HepG2及正常细胞系人胚肺成纤维细胞HELF、人肝细胞LO2。（2）采用Western-blot技术检测重组腺病毒感染细胞后,ODC和SAMDC蛋白表达情况。（3）采用MTS实验检测重组腺病毒对各株细胞增殖的抑制作用。（4）采用流式细胞术检测重组腺病毒对各细胞周期分布的影响。（5）采用Matrigel侵袭实验分析重组腺病毒对肿瘤细胞侵袭活性的影响。【实验结果】（1）腺病毒对A549细胞的最适感染滴度为50MOI,对其它细胞为25MOI。分别以该MOI的重组腺病毒感染A549、Bel-7402和HepG2肿瘤细胞可明显抑制其生长增殖,最大抑制率分别为65%、62%和55%;但对HELF和LO2正常细胞抑制生长作用不明显。（2）腺病毒感染肿瘤细胞后,可明显抑制ODC和SAMDC基因表达。rAd-hTERT-ODC对A549、Bel-7402和HepG2肿瘤细胞中ODC的抑制分别达50%、60%、50%,rAd-hTERT-SAMDC对SAMDC的抑制可达40%、50%、40%。两种重组腺病毒对正常细胞内的ODC和SAMDC均未见有明显抑制作用。（3）流式细胞DNA含量分析显示,两种重组腺病毒可引起肿瘤细胞周期阻滞于G₀-G₁期,但并未引起明显凋亡。对于正常细胞,rAd-hTERT-ODC和rAd-hTERT-SAMDC组与rAd-GFP组、PBS组未见明显改变。（4） Matrigel侵袭实验显示,重组腺病毒可显著抑制体外肿瘤细胞的侵袭能力。【结论】两组重组腺病毒rAd-hTERT-ODC、rAd-hTERT-SAMDC分别能有效抑制肿瘤细胞中ODC和SAMDC基因的表达,使细胞周期阻滞于G₀-G₁期,抑制肿瘤细胞的增殖活性,并明显抑制肿瘤细胞的侵袭活力。而对于正常细胞却没有明显抑制作用。从而初步证明rAd-hTERT-ODC、rAd-hTERT-SAMDC通过靶向性的抑制肿瘤细胞中多胺的合成,目的性抑制肿瘤的生长;重组病毒对于正常细胞却是相对安全的。