目的本研究采用体外培养的原代脑微血管内皮细胞(rBMEC)模拟血脑屏障模型,以丹红注射液及其主要有效成分丹参素、原儿茶醛、羟基红花黄色素A和丹酚酸B配伍为研究对象,从细胞水平和分子水平探讨其对缺氧缺血损伤脑微血管内皮细胞的保护作用机制,进一步研究其配伍规律,阐明中药复方的配伍原理和科学性。方法1、建立缺氧损伤脑微血管内皮细胞模型及鉴定:取新生小鼠脑皮层,采用两次酶消化、两次过筛、梯度离心、漂洗、接种到培养瓶进行原代培养;待细胞铺满孔板,用兔抗鼠Ⅷ因子抗体和Ⅱ抗进行免疫鉴定;选取生长成致密单层细胞,换无血清M199培养基,放入缺氧罐内通入4%CO2、1%O2和95%N2混合气体15 min后,继续培养4h建立缺氧模型,进行显微观察和透射电镜观察。2、毒性试验确定各组给药浓度:采用MTT法确定尼莫地平、丹红注射液及其有效成分对细胞的非毒性剂量;选取适宜浓度分组:正常组、缺氧模型组、丹红注射液高中低剂量组、有效成分配伍组、尼莫地平阳性对照组。3、丹红注射液及有效成分配伍对缺氧损伤细胞氧化损伤的影响:采用比色法、TBA法、WST-1法及Folin-酚分别检测各组细胞上清液LDH含量、细胞内MDA水平、SOD活性和总蛋白含量,分析各组细胞氧化损伤程度。4、丹红注射液及有效成分配伍对缺氧损伤细胞炎症因子的影响:采用RT-PCR法检测各组细胞MMP-9、ICAM-1 mRNA的表达水平,分析各组细胞炎症损伤程度。5、丹红注射液及有效成分配伍对缺氧损伤细胞凋亡的影响:采用流式细胞术检测各组细胞早期凋亡率和细胞周期,RT-PCR法检测细胞P53 mRNA的表达水平,分析各组细胞凋亡情况。结果1、原代细胞观察鉴定及缺氧对细胞形态的影响:原代脑微血管内皮细胞呈短梭形或多角形,培养7d后,细胞铺满培养孔成典型的“铺路石”样外观;Ⅶ因子相关抗原及Ⅱ抗鉴定,细胞核出现红色荧光,胞质出现强绿色荧光;缺氧4h后,贴壁细胞皱缩、变圆、脱落,体积明显缩小,轮廓模糊,紧密连接消失,与周围的细胞脱离;透射电镜观察出现细胞早期凋亡经典现象,染色质固缩,且细胞核染色质明显边集。2、毒性试验:随体积增加,丹红注射液促细胞增殖作用增强,100 时达到平台期;确定丹红注射液加药量(100、50、25 μL/mL)、尼莫地平加药量(200 mg/L)、各有效成分高中低浓度正交配伍9组。3、抗氧化损伤:尼莫地平与100、50 μL/mL丹红注射液明显抑制上清液LDH含量,增强胞内SOD活性,降低MDA水平;25μL/mL组未见明显作用;配伍1、2、3、9号组方显著抑制上清液LDH含量;配伍1、7号组方明显增强SOD活性;配伍1、2、9号组方显著降低MDA水平。4、抗炎症损伤:尼莫地平与100、50 μL/mL丹红注射液能显著下调缺氧细胞ICAM-1、MMP-9 mRNA的表达;25 μL/mL组仅能下调MMP-9 mRNA的表达;配伍1、3、6、9号组方明显下调MMP-9 mRNA的表达;配伍1、9号组方显著下调ICAM-1 mRNA的表达。5、抗凋亡损伤:尼莫地平与100、50 μL/mL丹红注射液能显著下调P53 mRNA表达来抑制缺氧诱导的细胞早期凋亡和G1/S期阻滞;而25 μL/mL组未见明显作用;配伍1、6、9号组方显著抑制细胞早期凋亡;配伍1、9号组方能明显抑制细胞发生G1/S期阻滞;配伍1、6、9号组方显著下调P53 mRNA的表达。结论本研究成功培养原代脑微血管内皮细胞,作为研究血脑屏障的体外模型,成功建立缺氧损伤模型。研究表明,丹红注射液及其有效成分配伍对缺氧损伤脑微血管内皮细胞具有明显的保护作用,其作用机制可能为:保护脑微血管内皮细胞形态结构完整,增强清除氧自由基能力,减弱脂质过氧化程度,减轻氧化应激损伤;下调P53 mRNA表达来抑制rBMEC早期凋亡和G1/S期阻滞;下调ICAM-1 mRNA表达介导黏附反应、促进内皮细胞迁移、降低内皮细胞活性;下调MMP-9 mRNA表达促进血管生成等。