[背景]乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一。近年来,在中国尤其是在大型城市,乳腺癌发病率不断攀升,严重影响女性身心健康。乳腺癌与遗传、年龄、内外源性雌激素增多等多种因素相关,但其确切病因和发病机制目前尚无定论。深入探讨乳腺癌发生发展过程中的分子改变,对患者的预后及治疗具有十分重要的意义。B族Ⅰ型清道夫受体(Scavenger receptor class B type Ⅰ,SR-BI)是清道夫受体家族的一员,位于细胞膜caveolae内,作为高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)受体参与HDL介导的胆固醇逆向转运过程。随着近几年脂代谢在癌症发病过程中的作用逐渐成为研究热点,已经有研究发现SR-BI表达于多种肿瘤组织和肿瘤细胞系中,但是关于SR-BI在人体乳腺癌组织中的表达情况、SR-BI表达与乳腺癌临床病理特征的相关性以及SR-BI在乳腺癌发生发展中的作用知之甚少。乳腺癌的组织学类型包括导管癌、小叶癌、粘液腺癌、腺样囊性癌等,其中以导管癌最为常见,占全部乳腺癌的70%-80%。因此在本课题中,我们针对SR-BI在人体乳腺浸润性导管癌(Invasive ductal carcinoma,IDCA)及乳腺导管原位癌(Ductal carcinoma in situ,DCIS)组织中的表达、SR-BI与乳腺癌临床病理特征的相关性及其在乳腺癌肿瘤细胞中的作用进行了探讨。[目的]研究B族Ⅰ型清道夫受体SR-BI在乳腺癌中的表达规律,分析SR-BI表达与乳腺癌临床病理特征的相关性及其与乳腺癌预后的关系,探讨其对乳腺癌诊断、预后和靶向治疗的意义。脂质体转染SR-BI小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA)敲低乳腺癌细胞株MCF7和MDA-MB-231中SR-BI表达,分析SR-BI在乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡中的作用,探讨SR-BI基因对信号通路表达的调控机制,为深入研究SR-BI对乳腺癌的作用提供理论依据。[方法]1、收集济南市第四人民医院病理科2008年6月至2010年12月期间乳腺导管癌组织蜡块共250例作为研究对象,其中浸润性导管癌200例,导管原位癌50例,同时随机抽取30例癌旁正常乳腺组织作为对照。所用病例均经两名资深病理医师双盲复审阅片,证实病理诊断及组织学分级准确可靠。2、采用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)两步法检测SR-BI在浸润性导管癌、导管原位癌及癌旁正常乳腺组织中的表达情况。由两名病理医师阅片,并根据设定的免疫组化染色判读标准给出染色阴性或阳性的结果。统计分析SR-BI在浸润性导管癌、导管原位癌和癌旁正常乳腺组织中的表达差异。3、调阅200例浸润性导管癌患者病历资料,收集其临床病理指标,包括年龄、病理分级、pTNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移、ER及PR表达情况,电话随访病人生存期等信息。利用X2检验分析SR-BI表达和患者临床病理指标之间的相关性,Kalpan-Meier法绘制生存曲线,Log-rank时序检验进行生存率的比较,使用Cox单因素和多因素分析进一步明确SR-BI是否为乳腺浸润性导管癌的独立预后因素,P<0.05为差异具有统计学意义。4、收集山东大学齐鲁医院乳腺癌手术新鲜癌组织标本共30例,其中23例乳腺浸润性导管癌,7例乳腺导管原位癌,同时收集20例癌旁无瘤组织作为对照。Western Blot法检测SR-BI基因在30例乳腺癌及正常对照中的表达,X2检验分析表达差异。5、以乳腺癌细胞系MDA-MB-231及MCF7为体外研究模型,脂质体转染SR-BI siRNA敲低MDA-MB-231及MCF7中SR-BI表达。使用荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,Q-PCR)和 Western Blot 法检测表达情况。6、CCK8法检测敲低SR-BI后对乳腺癌细胞增殖能力的影响。将转染24h后的细胞接种到96孔板中,每隔24h使用CCK8法测一次OD值,比较各组间细胞增殖的差异。7、平板克隆实验观察敲低SR-BI后乳腺癌细胞克隆形成能力的变化。将转染后的实验组和对照组细胞分别接种到60mm的培养皿中定期观察,形成肉眼可见的克隆时固定染色并拍照观察计数,比较各组克隆形成的大小和数目。8、划痕愈合实验检测敲低SR-BI后对乳腺癌细胞迁移能力的影响。乳腺癌细胞转染si-SR-BI后,待细胞密度达到100%时,使用黄色枪头在做好标记的孔板上画线,PBS洗去细胞碎片,更换成低血清培养基培养,每隔6-12h拍照一次,统计软件分析各组细胞迁移能力的差异。9、Transwell侵袭实验检测敲低SR-BI后对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。乳腺癌细胞转染24h后消化,使用无血清培养液制备细胞悬液100μl加入transwell小室的上室,并在下室加入600μl含10%胎牛血清的DMEM完全培养液,过夜培养。拍照计数穿膜细胞数,评价细胞的侵袭能力。10、流式细胞术检测敲低SR-BI的表达对乳腺癌细胞凋亡能力的影响。乳腺癌细胞转染24h后,更换成无血清培养基饥饿处理细胞诱导凋亡,Annexin V-PI法染色后使用流式细胞仪检测各组间凋亡细胞比例。11、Western Blot法检测敲低SR-BI后对凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、活化Caspase3表达的影响,以及敲低SR-BI后对PI3K/AKT信号通路和ERK信号通路等其他信号通络的影响。[结果]1、SR-BI蛋白在乳腺浸润性导管癌中表达增高SR-BI蛋白的阳性表达定位于乳腺癌细胞的细胞质和/或细胞膜中,镜下为淡黄色或者棕黄色颗粒状。按照免疫组化评分标准,SR-BI在乳腺浸润性导管癌中阳性表达率为55%,在导管原位癌和正常乳腺组织中阳性表达率分别为38%和33.3%,统计学分析显示SR-BI在浸润性导管癌中的阳性表达率高于导管原位癌和癌旁正常乳腺组织。Western Blot法检测新鲜组织中SR-BI的表达量高于导管原位癌与正常乳腺组织,与免疫组化结果一致提示SR-BI蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达增高。2、SR-BI表达与乳腺浸润性导管癌患者临床病理指标的关系临床病理分析发现SR-BI表达和病理分级、pTNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移相关,与年龄及ER、PR的表达程度无关。3、SR-BI表达与患者预后的相关性Kalpan-Meier法及Log-rank时序检验结果显示SR-BI阳性表达患者总体生存时间较阴性表达患者短,SR-BI阳性表达与患者总体生率下降相关;其他预后不良因素包括年龄、病理分级、pTNM分期、淋巴结转移及ER缺失均与患者总体生存率相关。Cox单因素生存分析结果显示,SR-BI阳性表达、年龄、病理分级、pTNM分期、淋巴结转移及ER缺失均会影响患者总体生存期。Cox多因素生存分析结果显示,病理分级、SR-BI阳性表达是影响乳腺浸润性导管癌患者预后的独立危险因素。4、SR-BI siRNA转染乳腺癌细胞后,在mRNA和蛋白水平抑制SR-BI表达MDA-MB-231 及 MCF7 细胞转染 si-SR-BI 后,Q-PCR 和 Western Blot 法检测结果显示SR-BI在mRNA和蛋白水平的表达显著降低,差异具有统计学意义,表明MDA-MB-231及MCF7细胞株转染SR-BI siRNA成功,SR-BI表达沉默。5、SR-BI在乳腺癌细胞中的生物学功能研究(1)敲低SR-BI表达能抑制乳腺癌细胞的增殖和克隆形成CCK-8法实验结果显示:敲低SR-BI的表达后,si-SR-BI组OD值在48h及72h显著低于对照组,细胞增殖能力下降。平板克隆法结果显示,敲低SR-BI的表达后,si-SR-BI组乳腺癌细胞的克隆形成能力较对照组显著减弱。(2)敲低SR-BI的表达能抑制乳腺癌细胞的迁移能力划痕愈合实验结果表明:敲低SR-BI的表达之后,在48h时,si-SR-BI组划痕远大于对照组,结果差异显著(P<0.05),MCF7和MDA-MB-231细胞的迁移能力均受到显著抑制。(3)敲低SR-BI的表达能抑制乳腺癌细胞的侵袭能力Transwell侵袭实验结果表明:与对照组比较,敲低SR-BI后MCF7和MDA-MB-231的穿膜细胞个数较少,细胞的侵袭能力降低,差异显著(P<0.05)。(4)敲低SR-BI的表达能促进乳腺癌细胞的凋亡流式细胞术结果表明.:与对照组比较,沉默SR-BI后MCF7和MDA-MB-231细胞凋亡比例明显增加,差异显著(P<0.05)。同时,使用Western Blot法检测凋亡相关蛋白的表达情况,实验结果表明,敲低SR-BI的表达后,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量显著下降,促凋亡蛋白Bax、活化caspase3表达量则相应的增高。6、敲低SR-BI的表达对PI3K/AKT信号通路的影响敲低SR-BI后可以抑制PI3K/AKT信号通路的激活,作为PI3K/AKT信号通路开关分子的抑癌基因PTEN被激活,AKT、mTOR的磷酸化水平下降,下游的靶基因CyclinD1和P70的表达量也相应下降。7、其他信号通路与对照组相比,敲低SR-BI后可以抑制ERK信号通路的激活,ERK的磷酸化(p-ERK)受到抑制。同时抑癌基因P53的表达量也相应的减少。ER的表达未有明显的变化。[结论]1、人乳腺浸润性导管癌中SR-BI表达明显增高,其表达与病理分级、pTNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移相关;SR-BI阳性表达与患者总体生存率下降相关,是影响浸润性导管癌患者预后的独立危险因素。SR-BI作为一个新近发现的肿瘤标记物,可能和乳腺癌的进展及患者的预后高度相关,有望成为乳腺癌的预后指标和分子治疗靶点。2、通过细胞学水平实验证实,SR-BI可以促进MDA-MB-231细胞及MCF7细胞增殖、侵袭、迁移,敲低SR-BI表达可诱导乳腺癌细胞凋亡。同时敲低SR-BI的表达可以抑制PI3K/AKT信号通路的激活,抑制ERK磷酸化和P53蛋白的表达水平。本实验为深入研究SR-BI对乳腺癌的作用提供理论依据,同时对以SR-BI为潜在治疗靶点的研究具有一定的指导意义。